董華英，王偉，陳元文，包俊杰，陳鑫，吳誠(chéng)義

（1. 海南省人民醫(yī)院 乳腺外科，海南 海口 570311；2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普通外科，重慶400016 ）

乳腺癌是一個(gè)高度異質(zhì)性的疾病，研究發(fā)現(xiàn)其至少分為十幾個(gè)亞型，由于技術(shù)條件所限，臨床上無(wú)法精準(zhǔn)分型，目前臨床上常分為4個(gè)亞型：Luminal A型、Luminal B型、HER-2陽(yáng)性和三陰性乳腺癌[1-4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞可能起源于未分化的、具有自我更新和一定多系分化潛能的細(xì)胞亞群，即乳腺癌干細(xì)胞（breast cancer stem cells，BCSC）。筆者前期研究[6-9]發(fā)現(xiàn)Luminal A型和基底樣型乳腺癌生物學(xué)特性存在明顯差異，其可能起源于不同類型的BCSC。目前對(duì)Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌的原代腫瘤干細(xì)胞研究尚不多見(jiàn)，本研究擬從Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌的癌組織中分離乳腺癌原代細(xì)胞，通過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)獲取富含BCSC的非黏附性微球體（mammosheres，MS），比較Luminal A型和HER-2陽(yáng)性BCSC的特性，探討Luminal A型和HER-2陽(yáng)性BCSC的生物學(xué)行為的差異。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

擇取重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科2016年1月—2016年6月收治的未接受過(guò)新輔助治療的乳腺癌女性患者20例，術(shù)前均經(jīng)空芯針穿刺后確診為乳腺癌。年齡38～60歲，平均年齡43.6歲。根據(jù)免疫組化進(jìn)行分型，其中Luminal A型10例，HER-2陽(yáng)性乳腺癌10例。標(biāo)本的收集均經(jīng)患者和親屬同意，手術(shù)開(kāi)始前取材，一般切取1～1.5 cm3標(biāo)本，放置于含有DMEM-F12培養(yǎng)基的滅菌廣口瓶中，盡快送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理部門審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)

D M E M-F 1 2培養(yǎng)基，B 2 7細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，胰蛋白酶和胎牛血清（Gibco），D-Hank's平衡液（HyClone），表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（b F G F）（美國(guó)P e p r o T e c h公司），M a t r i g e l膠（美國(guó)B D Bioscience），ALDEFLUOR?干細(xì)胞鑒定試劑盒（加拿大StemCell公司）；倒置顯微鏡（Olympus Corporation），超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)），Thermo Forma 371高溫滅菌CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。本實(shí)驗(yàn)在眼科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 MS的無(wú)血清培養(yǎng)傳代及形態(tài)觀察

修剪標(biāo)本，剪除多余的脂肪和凝血，放置標(biāo)本于培養(yǎng)皿中，用眼科手術(shù)剪剪碎標(biāo)本，然后用D-Hank's液反復(fù)沖洗剪碎的組織使細(xì)胞充分過(guò)濾，收集細(xì)胞后離心，棄上清，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后再次離心收集細(xì)胞，用添加生長(zhǎng)因子的DMEM-F12培養(yǎng)基（1:50 B27，20 ng/mL EGF，20 ng/mL bFGF）重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×105個(gè)細(xì)胞/mL接種于25 mm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d左右換液1次。每日在顯微鏡下觀察MS的形成和發(fā)展過(guò)程。7～10 d左右傳代1次，傳代時(shí)離心收集細(xì)胞后用D-Hank's液沖洗兩遍，加入0.05%的胰蛋白酶消化細(xì)胞10 min，細(xì)化過(guò)程中可用滴管吹打細(xì)胞，球體消失后再次離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后繼續(xù)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.4 MS的細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

用胰酶將MS消化成單細(xì)胞，即微球體細(xì)胞（mammospheres-derived cells，MSDC）。MS用胰酶消化后用添加生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔100個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d每孔添加少量培養(yǎng)液，7 d后按下列公式計(jì)算各孔的MS形成率（mammospheres formation efficiency，MSFE）。MSFE（%）=MS數(shù)量/接種細(xì)胞數(shù)量×100%。每次傳代后同法計(jì)算MSFE。

1.5 MSDC的在無(wú)血清培養(yǎng)基和添加血清的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

用胰酶將MS消化成單細(xì)胞，即MSDC。隨機(jī)選取Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌標(biāo)本各5例，收集第2代MSDC，將細(xì)胞用24孔板培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)，每孔1×103個(gè)細(xì)胞，每例標(biāo)本細(xì)胞被分為4組，每組細(xì)胞3孔。3 d后計(jì)數(shù)，每次取1組細(xì)胞，消化成單細(xì)胞，分別用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算數(shù)據(jù)平均數(shù)，隔3 d計(jì)算數(shù)據(jù)1次，連續(xù)3次。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，繪制MS的生長(zhǎng)曲線。同法將MSDC接種于有經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)處理蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，收集細(xì)胞并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSDC及其分化細(xì)胞中的ALDH1+細(xì)胞

離心收集MSDC，反應(yīng)緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106/mL；吸取1 mL細(xì)胞懸液至測(cè)試管，5 μL抑制劑DEAB加入陰性對(duì)照管，吸取5 μL活化底物加入到測(cè)試管，與細(xì)胞懸液混勻，立即吸取0.5 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到對(duì)照管，液體混勻，將試管于37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min；然后250r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄上清液，用0.5 mL緩沖液重懸測(cè)試管和對(duì)照管細(xì)胞，4 ℃保存細(xì)胞于24 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)或立即上機(jī)檢測(cè)。

1.7 NOD/SCID小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)

圖1 MS形態(tài)特征（×200） A：來(lái)源于HER-2陽(yáng)性型乳腺癌的成熟MS；B：來(lái)源于Luminal A型乳腺癌的成熟MSFigure 1 Morphological characteristics of MSs (×200) A: Mature MSs derived from HER-2-positive breast cancer; B: Mature MSs derived from Luminal A breast cancer

選擇4～6周齡NOD/SCID雌性小鼠10只，置入SPF級(jí)清潔動(dòng)物房帶層流架鼠盒中飼養(yǎng)，分為L(zhǎng)uminal A型組和HER-2陽(yáng)性組，每組5只。收集細(xì)胞并用培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/mL，加入基質(zhì)膠，配成體積比1:1的混合物，此時(shí)細(xì)胞濃度為1×104/mL，取0.1mL接種于NOD/SCID小鼠左前胸皮下。定期觀察皮下腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間，測(cè)量腫瘤的大小，隔日觀察1次，觀察7周，第8周處死小鼠，將腫瘤完整剝離后觀察腫瘤的體積、顏色及質(zhì)地，取各組腫瘤組織以10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色后用顯微鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，通過(guò)SPSS 17.0中文版進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，MSFE（%）采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種類型乳腺癌的MS培養(yǎng)及形態(tài)特征

兩類乳腺癌均可在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下形成微球體狀細(xì)胞團(tuán)，形成過(guò)程相似。接種48～72 h后可形成MS，7 d左右MS達(dá)到成熟狀態(tài)，體積不再增大。HER-2陽(yáng)性乳腺癌的細(xì)胞增殖快，MS形成較早，細(xì)胞密度更高，細(xì)胞之間連接更加緊密，但組成球體的細(xì)胞直徑小。其成熟MS直徑較大，平均直徑為（123±8）μm，培養(yǎng)過(guò)程中球體更容易貼壁生長(zhǎng)，出現(xiàn)分化細(xì)胞（圖1A）；Luminal A型乳腺癌的成熟MS直徑較小，平均直徑為（52±5）μm，組成球體的細(xì)胞數(shù)量少，直徑大，更容易懸浮生長(zhǎng)，但容易產(chǎn)生懸浮的單細(xì)胞（圖1B）。

2.2 Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌的MSDC的傳代能力和克隆形成能力比較

兩類乳腺癌的MSDC經(jīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)均可形成MS結(jié)構(gòu)樣的細(xì)胞團(tuán)，并能連續(xù)傳代，在傳代過(guò)程中隨著傳遞次數(shù)的增多，產(chǎn)生的MS體積逐漸變小，數(shù)量也相應(yīng)的減少。HER-2陽(yáng)性乳腺癌的MSDC具有更強(qiáng)的傳代能力，傳代次數(shù)可達(dá)10代，而Luminal A型乳腺癌的MSDC最多傳至6代，傳至第7代時(shí)培養(yǎng)基中已無(wú)MS形成。HER-2陽(yáng)性乳腺癌的MSDC的原代克隆為（4.28±0.68）%，而Luminal A型乳腺癌僅為（2.46±0.36）%，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。為了更加直觀的比較兩類乳腺癌傳代過(guò)程的MSDC克隆形成率變化，隨機(jī)選取兩類乳腺癌各5例標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)后繪制圖表如下（圖2）。

圖2 兩類乳腺癌MSDC連續(xù)傳代過(guò)程中的克隆形成率Figure 2 Colon formation rates of the MSDCs derived from Luminal A and HER-2-positive breast cancer after serial passages

2.3 Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌的MSDC增殖能力的比較

在無(wú)血清培養(yǎng)基中兩者的MSDC均呈球形生長(zhǎng)，起初3 d兩者差異較小，新生MS數(shù)量少，增殖能力差異不太明顯，3 d后，相對(duì)于Luminal A型乳腺癌，HER-2陽(yáng)性乳腺癌的MSDC增殖速度較快，兩者之間有明顯差異（P＜0.05）。6 d后兩者的MS數(shù)量增長(zhǎng)均變緩，生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定期，生長(zhǎng)曲線走勢(shì)平緩（圖3）。

2.4 Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌的MSDC分化潛能比較

在添加胎牛血清的培養(yǎng)基中，單細(xì)胞不再懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞改為貼壁生長(zhǎng)。兩者均有一段時(shí)間的生長(zhǎng)停滯期，細(xì)胞增殖較慢，但HER-2陽(yáng)性乳腺癌的MSDC在接種2 d后增殖迅速，4 d后即可與周圍細(xì)胞完全融合；Luminal A型的MSDC于4 d后才迅速增殖，5 d后細(xì)胞完全融合。兩者的MSDC分化生長(zhǎng)曲線：2 d內(nèi)兩者生長(zhǎng)曲線平緩，且有上升趨勢(shì)，兩者對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相似，但相對(duì)Luminal A型組，HER-2陽(yáng)性乳腺癌的MSDC增殖速度較快（P＜0.05）（圖4）。

圖3 MSDC在無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Figure 3 The growth curves of MSDCs in the serum-free medium

圖4 培養(yǎng)基中添加胎牛血清后MSDC的生長(zhǎng)曲線Figure 4 The growth curves of MSDCs in medium containing fetal bovine serum

2.5 ALDH1+表型細(xì)胞在MSDC中的表達(dá)

兩種亞型的乳腺癌MSDC中均含有ALDH1+表型細(xì)胞，通常HER-2陽(yáng)性乳腺癌較Luminal A型的MSDC含有更高比例的ALDH1+表型細(xì)胞，前者ALDH1+表型細(xì)胞的平均水平（13.26±1.20）明顯高于后者（5.20±0.58），兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖5）。

2.6 Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌的MSDC致瘤能力比較

HER-2陽(yáng)性乳腺癌組5只小鼠均可成瘤，接種2周后在接種部位肉眼可見(jiàn)腫瘤包塊形成，8周測(cè)直徑10.0～18.0 mm，Luminal A型組只有3只小鼠成瘤，接種3周后在接種部位可捫及腫瘤包塊，8周后直徑達(dá)5.2～13.0 mm（圖6）。兩類乳腺癌病理切片HE染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大小不等，細(xì)胞核增大，染色加深，核漿比例倒置，具備惡性腫瘤的典型特征（圖7）。

圖6 移植瘤生長(zhǎng)情況 A：HER-2陽(yáng)性乳腺癌MSDC移植；B：Luminal A型乳腺癌MSDC移植Figure 6 Growth of xenograft tumors A: Transplantation with MSDCs derived from HER-2-positive breast cancer; B: Transplantation with MSDCs derived from Luminal A breast cancer

圖7 移植瘤病理切片（HE ×200） A：HER-2陽(yáng)性乳腺癌MSDC移植瘤；B：Luminal A型乳腺癌MSDC移植移植瘤Figure 7 Pathological features of the xenograft tumors (HE ×200) A: Xenograft of MSDCs from HER-2-positive breast cancer;B: Xenograft of MSDCs from Luminal A breast cancer

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSDC中ALDH1+表型細(xì)胞 A: 來(lái)源于HER-2陽(yáng)性型乳腺癌的MSDC；B: 來(lái)源于Luminal A型乳腺癌的MSDCFigure 5 The ALDH1+ phenotype cells in MSDCs detected by fl ow cytometry A: MSDCs derived from HER-2-positive breast cancer; B:MSDCs derived from Luminal A breast cancer

3 討 論

Luminal A型乳腺癌是各種乳腺癌中最常見(jiàn)分子亞型，其復(fù)發(fā)率低，對(duì)內(nèi)分泌治療敏感，而對(duì)化學(xué)治療不敏感，預(yù)后較好；HER-2陽(yáng)性乳腺癌常見(jiàn)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其惡性程度高，對(duì)化學(xué)治療和靶向治療敏感，預(yù)后較差[10-14]。Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌生物學(xué)行為的差異可能跟其干細(xì)胞起源不同相關(guān)[15]。本研究證實(shí)，Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌的原代細(xì)胞均可在無(wú)血清培養(yǎng)條件下形成富含BCSC的MS，經(jīng)胰酶消化成單細(xì)胞后能夠生成新的MS，并且能夠連續(xù)傳代，在添加血清的培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)分化，MSDC可在NOD/SCID小鼠皮下種植后形成與原發(fā)腫瘤性質(zhì)相似的腫瘤，MSDC表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞特征，證實(shí)Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌均含有BCSC。

在無(wú)血清培養(yǎng)系統(tǒng)中，BCSC可通過(guò)對(duì)稱分裂實(shí)現(xiàn)自我更新，并增殖形成MS。MS的大小和所含細(xì)胞的數(shù)量可反映出腫瘤干細(xì)胞的增殖能力[7-8]。本研究顯示，H E R-2陽(yáng)性乳腺癌的M S明顯比Luminal A型組大，生長(zhǎng)曲線顯示HER-2陽(yáng)性組的MSDC增長(zhǎng)速度明顯快于Luminal A型組的MSDC，培養(yǎng)6 d后，HER-2陽(yáng)性組的MSDC細(xì)胞數(shù)接近Luminal A型組MSDC的2倍。因此，HER-2陽(yáng)性乳腺癌的BCSC在體外相對(duì)于Luminal A型乳腺癌的BCSC對(duì)稱分裂和增殖能力更強(qiáng)，提示兩類乳腺癌的BCSC自我更新能力存在差異。

通過(guò)體外連續(xù)克隆形成實(shí)驗(yàn)可以觀察兩類乳腺癌的BCSC在傳代過(guò)程中自我更新能力的變化趨勢(shì)[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HER-2陽(yáng)性組的MSFE比Luminal A型組高，提示前者的MSDC含有更高比例的腫瘤干細(xì)胞，也表明其惡性程度更高。兩組乳腺癌的MSDC在連續(xù)傳代的過(guò)程中所形成的MS數(shù)量逐漸較少，MS體積逐漸變小，提示目前的無(wú)血清培養(yǎng)體系與體內(nèi)微環(huán)境存在差異，難以維持BCSC在體外的長(zhǎng)期連續(xù)傳代，該培養(yǎng)體系有待進(jìn)一步改進(jìn)或者發(fā)明新的乳腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。Dey等[17]在培養(yǎng)乳腺干細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，乳腺干細(xì)胞微球隨著傳代次數(shù)的增加，球體體積變小，數(shù)量也相應(yīng)減少，傳至5代后基本沒(méi)有乳腺球形成。他們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞自身的老化與無(wú)血清培養(yǎng)基中的高氧微環(huán)境和球體細(xì)胞端粒酶的丟失有關(guān)，其可進(jìn)一步影響其它未老化細(xì)胞的微環(huán)境（niche），最終導(dǎo)致乳腺干細(xì)胞自我更新能力和多向分化能力的下降。

在培養(yǎng)基添加胎牛血清后，BCSC無(wú)法維持其干性，其增殖方式不再以對(duì)稱分離為主，轉(zhuǎn)變?yōu)椴粚?duì)稱分裂，產(chǎn)生大量分化細(xì)胞，此種細(xì)胞就是乳腺癌細(xì)胞。因此，腫瘤的生長(zhǎng)速度取決于BCSC的分化增殖速度[18]。本研究生長(zhǎng)曲線顯示，HER-2陽(yáng)性乳腺癌較Luminal A型乳腺癌的MSDC分化速度快，提示HER-2陽(yáng)性乳腺癌生長(zhǎng)速度快，惡性程度高。動(dòng)物致瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HER-2陽(yáng)性乳腺癌成瘤時(shí)間短，形成的腫瘤體積大，進(jìn)一步證實(shí)HER-2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。

研究[19]表明，腫瘤細(xì)胞中干細(xì)胞所占的比例越大，其惡性程度也越高，高度惡性的乳腺癌中其BCSC的比例高達(dá)25%。HER-2陽(yáng)性乳腺癌的MSDC原代克隆形成率（4.28±0.68）%明顯高于Luminal A型乳腺癌（2.46%±0.36%），提示前者含有更高比例的BCSC。研究[20-27]發(fā)現(xiàn)，CD44+/CD24-/low細(xì)胞亞群具有BCSC的特征，其主要存在于基底樣型乳腺癌腫瘤干細(xì)胞之中，而ALDH1是公認(rèn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物之一，在多種惡性腫瘤中均存在該表型細(xì)胞。本研究流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HER-2陽(yáng)性組的MSDC含有更高比例的ALDH1+表型細(xì)胞，進(jìn)一步印證了HER-2陽(yáng)性乳腺癌所含BCSC比例高于Luminal A型乳腺癌，提示HER-2陽(yáng)性乳腺癌具有低分化和高度惡性的腫瘤干細(xì)胞基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究證實(shí)Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌的腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)存在明顯差異，提示兩者性質(zhì)不同，可能存在不同的起源，推測(cè)其分別起源于乳腺上皮干細(xì)胞和管腔型祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)。由于各分子亞型乳腺癌細(xì)胞標(biāo)記物尚不能統(tǒng)一，也提示BCSC也可能存在異質(zhì)性。但本研究尚不能證實(shí)Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌的BCSC是由不同的乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，還有待進(jìn)行兩者BCSC之間以及其與正常乳腺上皮干/祖細(xì)胞的基因比照研究證實(shí)。隨著干細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步，進(jìn)一步純化BCSC，研究Luminal A型和HER-2陽(yáng)性乳腺癌的腫瘤干細(xì)胞特性，對(duì)確定不同類型乳腺癌的干細(xì)胞起源，針對(duì)不同類型乳腺癌制定精準(zhǔn)的個(gè)體化治療具有重要意義。

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