吳奎海，伍啟康，李煒煊

(佛山市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東 佛山 528000)

臨床分離多重耐藥鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌Ⅰ類整合子與ISCR1研究

吳奎海，伍啟康，李煒煊

(佛山市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東 佛山 528000)

目的 了解臨床分離多重耐藥鮑曼不動桿菌和銅綠假單保菌Ⅰ類整合子與插入序列共同區(qū)1 (ISCR1)的分布情況。方法2010年1月至2013年12月共收集我院126株多重耐藥鮑曼不動桿菌和89株多重耐藥銅綠假單胞菌，采用PCR法擴增Ⅰ類整合酶、Ⅰ類整合子基因盒、ISCR1、ISCR1可變區(qū)。Ⅰ類整合基因盒和ISCR1可變區(qū)的PCR產(chǎn)物分別用HinfⅠ、RasⅠ進行酶切，相同類型酶切圖譜的PCR產(chǎn)物隨機挑取一例進行測序，測序結果在GenBank中用BlastN進行核酸序列同源性搜索。結果在多重耐藥鮑曼不動桿菌中，檢出79例Ⅰ類整合酶，67例Ⅰ類整合子基因盒陽性，含有6種類型；59例ISCR1陽性，其中9例ISCR1可變區(qū)陽性。在89株多重耐藥銅綠中，檢出41例Ⅰ類整合酶，36例Ⅰ類整合子基因盒陽性，含有10種類型；9例ISCR1陽性，其中4例ISCR1可變區(qū)陽性。有8株鮑曼不動桿菌和2株銅綠假單胞菌同時攜帶Ⅰ類整合子和ISCR1可變區(qū)結構。結論在多重耐藥銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌中，Ⅰ類整合子和ISCR1分布較廣。

多重耐藥；鮑曼不動桿菌；銅綠假單胞菌；整合子；ISCR1

近年來隨著抗生素的濫用，多重耐藥鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的耐藥給臨床治療帶來嚴重挑戰(zhàn)，整合子和插入序列共同區(qū)在耐藥基因的水平轉移中發(fā)揮重要作用。Ⅰ類整合子在臨床上最常見，與多種耐藥基因相關，可以捕獲和表達多種耐藥基因[1]。插入序列共同區(qū)1(insertion sequence common region 1，ISCR1)是一種類似IS-91的轉座元件，以滾環(huán)形式轉座鄰近的耐藥基因，有不同類型的耐藥基因可變區(qū)(variable region)[2]。本文主要對臨床分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的Ⅰ類整合子和ISCR1結構進行研究。

1 材料與方法

1.1 臨床菌株 留取南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院和佛山市第一人民醫(yī)院微生物室2010年1月至2013年12月微生物室分離的126株多重耐藥菌鮑曼不動桿菌和89株多重銅綠假單胞菌。多重耐藥菌定義為對下列五類抗菌藥物中至少三類抗菌藥物耐藥的菌株[3-4]：頭孢菌素、碳青霉烯類抗生素、含有β-內酰胺酶抑制劑的復合制劑、氟喹諾酮類抗菌藥物、氨基糖苷類抗生素。Vitek2-compact進行菌株屬種鑒定和藥敏試驗，根據(jù)CLSI 2015的標準判斷結果。質控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922。同一患者只取第一次分離株，紙片法-80℃凍存。

1.2 主要儀器和試劑 PCR擴增儀器為德國Eppendorf公司，凝膠成像儀為Bio-Rad公司，TaqDNA聚合酶、HinfⅠ和RasⅠ限制性內切酶購自TaKaRa公司。

1.3 PCR反應體系 Ⅰ類整合酶、Ⅰ類整合子基因盒、ISCR1、ISCR1可變區(qū)引物序列參考文獻[2，5]，具體見表1。細菌DNA提取采用TaKaRa公司試劑盒(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)，于-20℃保存。PCR反應體系為20 μL，DNA模板1 μL，TaqDNA聚合酶1 U，含Mg2+的10×buffer 2 μL，dNTP終濃度為200 μmol/L，上下游引物終濃度均為0.2 μmol/L，加入滅菌去離子水至20 μL。

表1 PCR反應引物序列

1.4 Ⅰ類整合子基因盒和ISCR1可變區(qū)酶切及序列分析 對Ⅰ類整合子基因盒和ISCR1可變區(qū)的PCR產(chǎn)物分別用HinfⅠ和RasⅠ進行酶切，初步判斷是否攜帶相同的耐藥基因。HinfⅠ和RasⅠ反應體系為：PCR產(chǎn)物5 μL，10×H Buffer 2 μL，Hinf I(10 U/μL)或RasⅠ(10 U/μL)0.5 μL，加入滅菌去離子水至20 μL，酶切產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳。不同類型酶切圖譜的PCR產(chǎn)物隨機挑取一例，送去華大基因科技公司測序，測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中用BlastN進行比對。

2 結 果

2.1 Ⅰ類整合酶與Ⅰ類整合子基因盒檢測 126株多重耐藥鮑曼不動桿菌Ⅰ類整合酶陽性率為62.7% (79/126)，89株多重耐藥銅綠假單菌Ⅰ類整合酶陽性率為46.1%(41/89)。對Ⅰ整合酶陽性菌株進一步檢測Ⅰ類整合子基因盒類型，鮑曼不動桿菌陽性率為53.2%(67/126)，銅綠假單菌陽性率為40.4%(36/89)。Ⅰ類整合酶陽性菌PCR擴增電泳見圖1。

2.2 ISCR1及可變區(qū)檢測 126株多重耐藥鮑曼不動桿菌ISCR1陽性率為46.8%(59/126)，89株多重耐藥銅綠假單菌ISCR1陽性率為16.9%(15/89)。對ISCR1陽性菌株進一步檢測ISCR1可變區(qū)，鮑曼不動桿菌陽性率為15.3%(9/59)，銅綠假單菌陽性率為4.5%(4/89)。ISCR1陽性菌PCR擴增電泳圖見圖2。

圖1 Ⅰ類整合酶電泳結果

圖2 ISCR1電泳結果

2.3 Ⅰ類整合子基因盒結構 67株Ⅰ類整合子陽性鮑曼不動桿菌株，經(jīng)酶切分析共含有6種基因盒；36株Ⅰ類整合子陽性銅綠假單胞菌，經(jīng)酶切分析共含有10種基因盒，具體的基因盒測序結果見表2。

表2 103株多重耐藥非發(fā)酵菌Ⅰ類整合子基因盒種類

2.4 ISCR1可變區(qū)結構 在9株鮑曼不動桿菌ISCR1可變區(qū)陽性菌株中，5株含有qnrA1+ampR，4株含有blaPER-1+GST+ABC transporter；4株銅綠假單胞菌ISCR1可變區(qū)陽性菌株中均含有qnrA1+ampR。

2.5 Ⅰ類整合子和ISCR1共存 有8株鮑曼不動桿菌和2株銅綠假單胞菌均含有Ⅰ類整合子和ISCR可變區(qū)，耐藥基因組合模式，見表3。

表3 Ⅰ類整合子和ISCR1共存攜帶的耐藥基因種類

3 討 論

Ⅰ類整合子是介導革蘭陰性桿菌的多重耐藥的重要原因之一，在本研究中多重耐藥鮑曼不動桿菌Ⅰ類整合酶陽性率為62.7%，低于黃帆等[6]報道的78.4%；多重耐藥銅綠假單胞菌的Ⅰ類整合酶陽性率為46.1%，低于肖曉光等[7]報道的56.1%。多重耐藥鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的Ⅰ類整合子基因盒種類有所不同，但有的同一基因盒在兩者均有分布，甚至有的單個耐藥基因可以和不同的耐藥基因形成組合，這些都反映了整合子能對基因盒進行捕獲和剪切使其發(fā)生移動。在鮑曼不動桿菌的6種Ⅰ類整合子基因盒類型菌株中，氨基糖苷類乙酰轉移酶的基因有aacA4、aacC1，編碼氨基糖苷類核苷轉移酶基因有aadA1、aadB、aadA2。catB8、catB3編碼氯霉素乙酰轉移酶介導酶滅活機制，乙?；蟮穆让顾夭荒芘c核糖體結合從而形成耐藥，dfrA15編碼二氫葉酸還原酶，對甲氧芐啶耐藥。arr-3編碼利福平ADP-核糖基轉移酶，導致對利福平耐藥。aacA4+catB8+aadA1最為常見，與國內外文獻報道一致，但不同地區(qū)耐藥基因盒種類有所差異，Chen等[8]對華東地區(qū)多重鮑曼不動桿菌研究顯示，aacA4+catB8+aadA1和dfrXII+orfF+ aadA2比率分別為84.3%、15.6%。臺灣地區(qū)報道的基因盒常見組合模式為aacA4+catB8+aadA1、aacC1+ orfX+orfX+orfX'+aadA1a、dfrXII+orfF+aadA2[9]。在歐洲國家流行的基因盒模式為aacA4+catB8+aadA1、aacA4、aacC1+orfX+orfX'+aadA1a、aacC1+orfX+orfX+ orfX'+aadA1a[10]。

Ⅰ類整合子與銅綠假單胞菌對頭孢類、單環(huán)β-內酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類和喹諾酮類抗菌藥物的耐藥有關，氨基糖類耐藥基因檢出aacA4、aac (6')-II、aadA2、aadA13、aadB等五種，cmlA8屬于特異性外排系統(tǒng)，通過主動泵出氯霉素使其在菌體內的含量明顯減少。在36株I類整合子陽性株中，blaIMP-9+ aacA4+blaOXA-10+aadA2最常見，占了44.4%(16/ 36)。黃小榮等[11]報道常見基因盒模式為blaPSE-1+ aadB、aac(6')-II+aadA13+cmlA8+blaOXA-10，在非洲地區(qū)流行aadA6+orfD、aadA13[12]。52.8%(19/36)的基因盒含有blaIMP-9，編碼金屬β-內酰胺酶基因，能水解碳青霉烯酶類抗生素。Xiong等[13]報道中國廣州地區(qū)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌攜帶的blaIMP-9基因，位于大約450 kb的TncP-2接合性質粒上可引起院內基因水平傳播。有69.4%(25/36)的Ⅰ類整合子含有D類β-內酰胺酶基因OXA-10、OXA-30，但未發(fā)現(xiàn)能水解碳青霉烯的OXA型酶。

在ISCR1結構研究中發(fā)現(xiàn)74株ISCR1陽性僅13株可變區(qū)擴增陽性，可能是ISCR1攜帶的耐藥基因下游不含有典型的3'-CS結構或片段過大，導致PCR擴增失敗，也可能是不含有任何耐藥基因。ISCR1大都與qnr相關，qnr屬于質粒介導的喹諾酮類耐藥基因，通常與ESBL、氨基糖苷類基因和AmpC酶共存。在此qnrA1都與amp相連，amp是對qnrA1的轉錄起調節(jié)作用，在9株菌均發(fā)現(xiàn)此耐藥基因組合模式。qnrA1+ ampR也在腸桿菌科細菌中發(fā)現(xiàn)，表明ISCR1攜帶qnrA1在不同屬種細菌之間水平轉移。此耐藥4株鮑曼不動桿菌的ISCR1可變區(qū)含有三個閱讀框PER-1+ GST+ABC組合模式，PER-1是ESBLs的一種，能水解頭孢噻肟、頭孢他啶、氨曲南，但對碳青霉烯類、頭霉素等敏感，它的遺傳環(huán)境與Tn1213有關[14]。GST的功能是谷胱甘肽硫化轉移酶，ABC編碼一個轉運體基因[2]。本研究結果發(fā)現(xiàn)76.9%(10/13)多重耐藥非發(fā)酵菌株同時攜帶Ⅰ類整合子和ISCR1，可能形成復雜性Ⅰ類整合子[15]，加快了多重耐藥性的水平傳播。

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Study on classⅠ integron and ISCR1 in clinical isolates of multidrug-resistant Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa.

WU Kui-hai,WU Qi-kang,LI Wei-xuan.Department of Clinical Laboratory,the First People’s Hospital of Foshan,Foshan 528000,GuangDong,CHINA

ObjectiveTo investigate the distribution situation of classⅠ integron and insertion sequence common region 1(ISCR1)in clinical isolates of multidrug-resistant Acinetobacter baumanii and Pseudomonas aeruginosa.MethodsA total of 126 strains of multidrug-resistant Acinetobacter baumanii and 89 strains of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa in our hospital between January 2010 and December 2013 were collected.ClassⅠintegrase, classⅠintegron gene cassette,ISCR1 and variable region of ISCR1 were amplified by PCR.PCR products of classⅠintegron and variable region of ISCR1 were digested with HinfⅠand RasⅠ,respectively.PCR products of different types of the restriction map were selected,sequenced,and then aligned with GenBank database using BlastN program.ResultsIn 126 cases of multidrug-resistant Acinetobacter baumanii,there were classⅠintegrase in 79 cases,classⅠintegron gene cassette in 67 cases,which contained 6 different types.ISCR1s were detected positive in 59 cases,of which variable region of ISCR1 was positive in 9 cases.In 89 cases of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa, there were classⅠintegrase in 41 cases,classⅠintegron gene cassette in 36 cases,which contained 10 different types. ISCR1 positive showed in 9 cases,of which variable region of ISCR1 was positive in 4 cases.Eight strains of Acinetobacter baumanii and two strains of Pseudomonas aeruginosa contained classⅠintegrase and variable region of ISCR1, simultaneously.ConclusionClassⅠintegron and ISCR1 are widespread in multidrug-resistant Acinetobacter baumanii and Pseudomonas aeruginosa.

Multidrug-resistant;Acinetobacter baumanii;Pseudomonas aeruginosa;Integron;Insertion sequence common region 1(ISCR1)

R378

A

1003-6350（2017)04-0594-04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.025

2016-08-21)

吳奎海。E-mail：wukuihai2000@163.com