王書珍++鄭壯++張志偉++張明菊++李志良++向福++楊谷良

摘要：水果具有加快人體體能恢復(fù)、延緩衰老的作用。研究利用DPPH法測定羅田甜柿（Diospyros kaki）果實(shí)水溶性提取物的抗氧化能力，經(jīng)優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件為40 ℃反應(yīng)15 min。1 g/mL的柿果實(shí)水溶性提取物相當(dāng)于1.5 mg/mL維生素C的抗氧化效率。對比甜柿果實(shí)提取物3種水性溶劑的抗氧化效率，水提取物的抗氧化活性最高，Tris-HCl緩沖液提取物次之，PBS緩沖液提取物抗氧化活性相對較差。

關(guān)鍵詞：羅田甜柿（Diospyros kaki）；水溶性提取物；DPPH法；抗氧化活性

中圖分類號：S665.2；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0542-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.038

Study on the Antioxidative Activity of Water-Soluble Extracts from Persimmon Fruit

WANG Shu-zhen，ZHENG Zhuang，ZHANG Zhi-wei，ZHANG Ming-ju，LI Zhi-liang，XIANG Fu，YANG Gu-liang

（Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resource Comprehensive Utilization/Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains/College of Life Science，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，Hubei，China）

Abstract： Fruits play an important part in quickening energy recovery and slowing aging process. the antioxidant capacity of water-soluble extracts from fruits of Diospyros kaki was measured with DPPH method. Results showed that the optimal reaction condition was at 40 ℃ for 15 minutes. The antioxidative capacity of 1 g/mL water-soluble extracts from persimmon fruit was equal to that of 1.5 mg/mL vitamin C. Comparing the antioxidative capacity of H2O，PBS，and Tris-HCl aqueous solvents，the best one was H2O，while the least one was PBS.

Key words： Diospyros kaki； soluble extracts； DPPH method； antioxidative activity

自由基是生物機(jī)體氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的游離態(tài)有害化合物，其氧化活性能夠引起動脈粥樣硬化、心血管疾病、腫瘤等多種慢性疾病[1]。天然抗氧化劑是從動、植物產(chǎn)生的具有抗氧化活性的物質(zhì)，如多酚類、黃酮類化合物、脂酸等[2]。抗氧化劑能中和生物體產(chǎn)生自由基，降低自由基對機(jī)體傷害的物質(zhì)，是現(xiàn)代醫(yī)藥、食品保健行業(yè)研究的重點(diǎn)。

柿（Diospyros kaki）屬柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros）落葉大喬木，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。柿原產(chǎn)于中國，廣泛分布于西北、華南、華北及西南等省區(qū)[3]。柿果實(shí)具有較高的食用和藥用價(jià)值，并且葉、花、皮和根均可入藥，特別是柿葉和柿果實(shí)的保健價(jià)值引起了人們的重視[4，5]。柿果實(shí)營養(yǎng)豐富，除碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦質(zhì)元素外，還含有大量的氨基酸、萘醌類、黃酮類、萜類、鞣質(zhì)、谷甾醇類、酚類、香豆素類、有機(jī)酸、胡蘿卜素、維生素C等生理活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、消炎、抗過敏、擴(kuò)張血管等生理功能，柿子單寧能夠有效抑制亞油酸的脂質(zhì)過氧化過程[6-9]。

本研究對羅田甜柿果實(shí)水溶性提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究，探討抗氧化的最優(yōu)反應(yīng)條件，為羅田甜柿抗氧化機(jī)制的闡述，天然抗氧化劑的開發(fā)、應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試驗(yàn)的羅田甜柿為自然成熟、新鮮無病害的果實(shí)，于2013年9月采自湖北省羅田縣，置于自封袋，并放于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 方法

1.2.1 樣品及其處理方法 柿子先后用自來水、滅菌去離子水沖洗干凈，去皮后取食用部分10 g，在研缽中按照1∶5的比例分別加入蒸餾水、PBS（0.1 mmol/L，pH 7.6）、Tris-HCl緩沖液（0.1 mmol/L，pH 7.2），研磨制備均勻液，6 000 r/min低溫離心10 min，留取上清液即為柿果實(shí)水溶性活性組分，置于4 ℃冰箱中保存，48 h內(nèi)用完。

1.2.2 最適濃度的篩選 利用柿果實(shí)水提取物進(jìn)行試驗(yàn)，總體積為5 mL（2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液+3 mL不同濃度的柿果實(shí)水提取物）。6組反應(yīng)體系內(nèi)柿果實(shí)活性提取物濃度分別為0.015、0.030、0.045、0.060、0.075、0.090 g/mL。同時(shí)設(shè)置陰性對照組1，反應(yīng)體系為2 mL DPPH溶液和3 mL滅菌H2O；以及陰性對照組2，反應(yīng)體系為2 mL無水乙醇和3 mL相應(yīng)濃度的柿果實(shí)水提取物。試驗(yàn)組和陰性對照組都重復(fù)3次。反應(yīng)體系在37 ℃反應(yīng)30 min，然后測定517 nm處的吸光度[10]，確定柿果實(shí)水提取物的最佳反應(yīng)濃度。

1.2.3 最適反應(yīng)溫度的篩選 利用優(yōu)化出的最佳反應(yīng)濃度，設(shè)置6組相同的反應(yīng)體系和2個(gè)陰性對照，分別在10、20、30、40、50、60 ℃條件下反應(yīng)30 min，然后測定517 nm處的吸光度，確定柿果實(shí)水提取物的最佳反應(yīng)溫度。

1.2.4 最適反應(yīng)時(shí)間的篩選 利用優(yōu)化出的最佳反應(yīng)濃度，設(shè)置8組相同的反應(yīng)體系和2個(gè)陰性對照，在最佳反應(yīng)溫度條件下分別反應(yīng)5、10、15、20、25、30、35、40 min，統(tǒng)計(jì)各反應(yīng)時(shí)間段的自由基清除率，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5 最適緩沖液研究 利用蒸餾水、PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液提取的柿果實(shí)提取物各3 mL與2 mL的DPPH在40 ℃條件下反應(yīng)30 min，測定517 nm處的吸光度，確定柿果實(shí)提取物自由基清除效率最高的緩沖溶液。

1.2.6 柿果實(shí)提取物與維生素C的抗氧化活性比較 將0.066 7 g/mL的柿子果實(shí)提取物3 mL與 2 mL的0.2 mmol/L的DPPH在40 ℃反應(yīng)15 min，統(tǒng)計(jì)自由基清除率。配制濃度為2 mg/mL的維生素C溶液，按照5 mL的反應(yīng)體系設(shè)置4組試驗(yàn)，維生素C的終濃度分別為0.100 0、0.010 0、0.005 0、0.002 5 mg/mL，40 ℃反應(yīng)15 min，計(jì)算維生素C的自由基清除效率，并與柿果實(shí)提取物對DPPH自由基清除率進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適濃度的篩選

在對DPPH自由基的清除過程中，隨著柿果實(shí)水溶性提取物濃度的增高，自由基清除率逐漸提高，即抗氧化能力是濃度依賴性方式進(jìn)行的（圖1）。在0.015 g/mL處理組內(nèi)，自由基清除率僅46.11%。0.030 g/mL和0.045 g/mL處理組內(nèi)的自由基清除率分別是55.99%和65.57%。當(dāng)柿果實(shí)提取物濃度增大到0.060 g/mL時(shí)，自由基清除率達(dá)到73.63%，比0.045 g/mL處理組自由基清除率增加了12.29%。然而，當(dāng)濃度再增加到0.075 g/mL和0.090 g/mL時(shí)，自由基清除率增幅較小，分別為79.63%和82.15%。

當(dāng)反應(yīng)濃度從0.060 g/mL再增加時(shí)，反應(yīng)進(jìn)入平臺期，自由基清除率雖然也在增高，但是增幅降低。在6組濃度不同的試驗(yàn)組內(nèi)，以0.060 g/mL的反應(yīng)體系效率最高，因此在后續(xù)的酶學(xué)參數(shù)分析中，以濃度為0.060 g/mL的柿果實(shí)提取物溶液作為檢測標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 最適反應(yīng)溫度的篩選

在柿果實(shí)濃度一致的情況下，隨著反應(yīng)溫度的不同，自由基清除率隨之而變化（圖2）。在溫度為10～40 ℃，隨著溫度的升高，體系的吸光度降低，自由基清除效率逐漸提高。在40～60 ℃的溫度區(qū)間內(nèi)，溫度升高，反應(yīng)體系的吸光度有所升高，即自由基清除效率逐漸降低。反應(yīng)溫度為40 ℃左右時(shí)，柿水溶性提取物具有相對于其他反應(yīng)溫度較高的清除DPPH自由基的能力，即抗氧化能力以40 ℃左右最強(qiáng)。

2.3 最適反應(yīng)時(shí)間的篩選

在柿果實(shí)提取物濃度和反應(yīng)溫度相同的條件下，隨著反應(yīng)進(jìn)程的進(jìn)行，檢測自由基清除率的變化（圖3）。在反應(yīng)時(shí)間為5～15 min隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，反應(yīng)體系的吸光度降低，自由基清除率逐漸增高。在15～40 min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間延長，反應(yīng)體系的吸光度基本不變，自由基清除率維持在84.5%左右。即在15 min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，柿果實(shí)的提取物的抗氧化能力最強(qiáng)。繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，對自由基的清除效率保持不變。因此，柿果實(shí)的抗氧化反應(yīng)在15 min時(shí)間內(nèi)效果最好。

2.4 緩沖液對自由基清除率的影響

在Tris-HCl緩沖液、蒸餾水、PBS緩沖液作為提取液時(shí)，水提取物的自由基清除效率最高，達(dá)到83.39%（圖4）。自由基清除效率最差的提取液為PBS緩沖液，僅為33.73%。Tris-HCl作為提取液時(shí)DPPH自由基清除率為55.89%，比水提取液低，但是高于PBS緩沖液。濃度為1 g/mL的柿果實(shí)水溶性提取物的自由基清除率相當(dāng)于質(zhì)量濃度1.5 mg/mL維生素C的自由基清除率，即抗氧化能力相當(dāng)。

3 討論

楊繼濤等[11]把柿果實(shí)中抗氧化物質(zhì)進(jìn)行了成分分析以及含量測定，對不同基因型柿果實(shí)中抗氧化物成分進(jìn)行測定，包括總酚、總黃酮、總黃烷醇及VC等，發(fā)現(xiàn)不同基因型柿果實(shí)之間總酚、總黃酮、總黃烷醇及VC含量區(qū)別很大，野生種君遷子的總酚、總黃酮、總黃烷醇及VC含量明顯高于栽培種的含量，并且抗氧化活性物質(zhì)總酚、總黃酮及總黃烷醇的含量與抗氧化能力間的相關(guān)性均達(dá)到顯著性差異（TBARS和HRSA除外），并認(rèn)為柿果實(shí)中所含有的多酚類物質(zhì)是柿果實(shí)抗氧化作用的重要因子之一。

2，4-二硝基苯肼和DPPH均為測定醛、酮類的顯色劑，二者都可以用來評價(jià)抗氧化能力。郭豫等[12]曾用改良過的2，4-二硝基苯肼比色法來評價(jià)抗氧化保健食品中蛋白質(zhì)羰基含量。本次試驗(yàn)用DPPH對柿果實(shí)水溶性提取物的抗氧化活性進(jìn)行了定性分析，對其最佳反應(yīng)條件進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)柿果實(shí)水溶性提取物具有較好地清除DPPH自由基能力，其達(dá)到最大抗氧化活性的反應(yīng)溫度為40 ℃，反應(yīng)時(shí)間為15 min，這一情況與張惠婷等[13]的研究也比較符合。

柿子營養(yǎng)豐富，含有大量的糖類、多種維生素，具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在甜柿功能產(chǎn)品開發(fā)方面，林嬌芬等[14]、周鑫堂等[15]研究發(fā)現(xiàn)柿葉具有抗氧化、降糖、抗腫瘤、調(diào)血脂、止血等藥理作用。關(guān)于柿皮，王繼之[16]對其中的有效成分進(jìn)行提取，而陳湘寧等[17]將柿皮與柿肉中抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行了研究與對比。本研究可為柿子抗氧化分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)，也為改善柿子品種特質(zhì)，開發(fā)柿子相關(guān)的功能食品提供參考。

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