耿衛(wèi)樸

人乳腺癌中共刺激分子PD-L1、PD-L2的表達(dá)及其臨床意義

耿衛(wèi)樸

目的探討共刺激分子 PD-L1、PD-L2在人乳腺癌的表達(dá)及其與臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性。方法采用免疫組化 SP兩步法檢測 PD-L1、PD-L2在10例正常乳腺組織、18例乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌和40例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)，并分析兩種共刺激分子的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果正常人乳腺腺上皮不表達(dá) PD-L1和 PD-L2，乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌弱表達(dá) PDL1和 PD-L2，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中 PD-L1和 PD-L2的陽性率分別為45%（18／40）、35%（14／40），顯著高于PD-L1和 PD-L2在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示PD-L1和PD-L2表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）密切相關(guān)。PD-L1和 PD-L2表達(dá)與 ER、PR表達(dá)（P＜0.05）有相關(guān)性，但 PD-L1、PD-L2表達(dá)與乳腺癌其他臨床病理特征無相關(guān)性。PD-L1和 PD-L2表達(dá)在 ER、PR、HER-2均陰性的乳腺癌患者中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 人乳腺癌癌細(xì)胞異常表達(dá)PD-L1和PD-L2，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；PD-L1和 PD-L2有望成為乳腺癌免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

乳腺腫瘤；PD-L1；PD-L2；免疫組織化學(xué)

自20世紀(jì)70年代末全球乳腺癌發(fā)病率一直呈上升趨勢，近年我國乳腺癌發(fā)病率的增長高于多發(fā)國家。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌腫瘤預(yù)后因素及腫瘤免疫逃逸機(jī)制，在乳腺癌中具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。T細(xì)胞免疫在識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤生長和擴(kuò)散中起重要作用，其有效活化是 T細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的前提，T細(xì)胞活化需要 TCR介導(dǎo)的抗原特異性信號(hào)和共刺激分子介導(dǎo)的共刺激信號(hào)［1］。程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、程序性死亡配體-2（programmed death ligand-2，PD-L2）是近年來發(fā)現(xiàn)的B7家族共刺激分子，它們抑制CD4陽性和CD8陽性T細(xì)胞的活化和增殖，負(fù)性調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答，從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤生長［2］。本文采用免疫組化 SP兩步法檢測10例正常人乳腺組織、18例乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌和40例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中 PD-L1、PD-L2的表達(dá)，旨在為乳腺癌尋找新的免疫治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集河南省中醫(yī)院病理科68例實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，其中包括人正常乳腺組織 10例、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌 18例和乳腺浸潤性導(dǎo)管癌40例?；颊吣挲g32～69歲，平均50.65歲，患者術(shù)前均未接受放、化療。所有組織采用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。

1.2 方法免疫組化采用SP兩步法，將切片脫蠟水化，3%H2O2孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，用 PBS液洗3次。切片放置枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）中進(jìn)行 PD-L1和 PD-L2抗原修復(fù)，待自然冷卻后用PBS洗3次。分別滴加一抗PD-L1、PD-L2抗體（稀釋比分別為 1∶100、1∶150），放置4℃冰箱過夜。切片用 PBS液洗3次后，滴加二抗山羊抗兔抗體，放置 37℃烤箱孵育 30 min，用 PBS液洗 3次后，經(jīng) DAB顯色蘇木精復(fù)染，中性樹脂封固。實(shí)驗(yàn)以 PBS替代一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷所有免疫組化陽性結(jié)果均呈棕色，PD-L1和 PD-L2陽性物定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果判定采用 Fromowitz半定量分級(jí)法，綜合陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度計(jì)分：陽性細(xì)胞＜10%為0分，10% ～25%為1分，26%～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分；細(xì)胞染色強(qiáng)度無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者得分之和為最終判定結(jié)果：0～1分為（－），2～5分為（＋～?），6～7分為（?）；其中（－）為陰性，（＋～?）為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0軟件的秩和檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 PD-L1、PD-L2在正常人乳腺腺上皮、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌和乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的表達(dá)正常人乳腺腺上皮不表達(dá) PD-L1和 PD-L2；乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌弱表達(dá)PD-L1和 PD-L2；乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌細(xì)胞PD-L1 和PD-L2的陽性率分別為45%（18／40）、35%（14／40），顯著高于 PD-L1和 PD-L2在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌的表達(dá)（Z＝－2.092，P＜0.05；Z＝－2.044，P＜0.05，表1，圖1）。

表1 PD-L1、PD-L2在不同乳腺組織的表達(dá)

2．2 PD-L1、PD-L2表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系PD-L1、PD-L2的表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.025，P＝0.019）密切相關(guān)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌病例轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶癌細(xì)胞均表達(dá)PD-L1和PD-L2。PD-L1、PD-L2的表達(dá)與ER、PR的表達(dá)（P＝0.023，P＝0.006）有相關(guān)性，但PD-L1、PD-L2表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌其他臨床病理特征無顯著相關(guān)性（表2）。

表2 PD-L1、PD-L2表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

2．3 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌 PD-L1、PD-L2的表達(dá)與ER、PR、HER-2的相關(guān)性分析 PD-L1、PD-L2的表達(dá)在 ER、PR、HER-2均陰性的乳腺癌患者中高表達(dá)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.097，P＝0.002）。ER／PR陰性的乳腺癌患者癌組織中高表達(dá) PD-L1、PD-L2，而ER／PR陽性的乳腺癌患者癌組織中PDL1、PD-L2的表達(dá)偏低（表3，圖2）。

圖1 A.乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌上皮中PD-L1呈弱陽性，SP兩步法；B.乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌上皮中 PD-L2呈弱陽性，SP兩步法；C.乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌細(xì)胞中 PD-L1呈弱陽性，SP兩步法；D.乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌細(xì)胞中 PD-L2呈弱陽性，SP兩步法；E.乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌細(xì)胞中PD-L1呈強(qiáng)陽性，SP兩步法；F.乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌細(xì)胞中PD-L2呈強(qiáng)陽性，SP兩步法

圖2 A.乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌細(xì)胞中 ER呈陽性，SP兩步法；B.乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌細(xì)胞中 PR呈陽性，SP兩步法；C.乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌細(xì)胞中 HER-2呈陽性，SP兩步法

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) PD-L1和 PD-L2在乳腺癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）有關(guān)，提示PD-L1和PD-L2可能參與抑制外周 T淋巴細(xì)胞免疫活性，促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn) PD-L1和 PDL2在乳腺癌間質(zhì)細(xì)胞中也有部分表達(dá)，文獻(xiàn)報(bào)道PD-L1可在靜息和活化的 T、B淋巴細(xì)胞、抗原提成細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞中表達(dá)；PD-L2也可少量表達(dá)于上述細(xì)胞［3］。作者推測這些間質(zhì)細(xì)胞部分可能為樹突狀細(xì)胞，部分可能為淋巴細(xì)胞。PD-L1和 PD-L2的受體為 CD28家族 PD-1，它的胞外區(qū)可與配體 PD-L的 IgV樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合，PD-1的ITSM結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸發(fā)生磷酸化，募集蛋白酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1）使下游的Zeta鏈相關(guān)蛋白（ZAP70）去磷酸化、下調(diào) CD3／CD28誘導(dǎo)的 PI3K／Akt激酶活性，使p56lck失活向T細(xì)胞內(nèi)傳遞免疫抑制信號(hào)，限制 T細(xì)胞的激活［4－5］，減少 IL-2、干擾素、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌，反而刺激免疫抑制性細(xì)胞因子 IL-10的分泌［6］，這些因子的異常表達(dá)在一定程度上可以抑制T細(xì)胞的功能，甚至誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，影響機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用［7－8］。在腫瘤患者中，應(yīng)用抗體阻斷PD-1／PD-L信號(hào)通路以治療腫瘤等疾病已成為近年研究的熱點(diǎn)，并已取得一定成果［9］。

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、治療預(yù)后與乳腺癌組織ER、PR、HER-2的表達(dá)有一定關(guān)聯(lián)性。ER、PR對乳腺組織的生長分化、增殖等起調(diào)控作用。有研究證實(shí)，ER、PR陰性的乳腺癌分化低、增殖快，術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［10－11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) ER／PR陰性的乳腺癌癌組織高表達(dá)PD-L1和PD-L2，而ER／PR陽性的乳腺癌 癌組 織 低表達(dá) PD-L1和 PD-L2。Ghebeh等［12－13］也報(bào)道 ER／PR陽性的乳腺癌表達(dá)PD-L1、PD-L2明顯降低。由此作者推斷通過阻斷 PD-1／PD-L這一信號(hào)途徑有可能減少ER、PR陰性乳腺癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率。

HER-2蛋白是一種酪氨酸蛋白，是定位于染色體17q2l上的原癌基因，可參與細(xì)胞的增殖分化、遷移等過程，還可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲能力［14］。隨著腫瘤基因?qū)W的發(fā)展，利用基因芯片技術(shù)，依據(jù)腫瘤表達(dá)的基因譜把乳腺癌分為不同亞組，分別為正常組織樣、管腔上皮型、HER-2過表達(dá)型和基底細(xì)胞樣。大多數(shù)基底細(xì)胞樣乳腺癌表現(xiàn)為 ER、PR、HER-2均陰性，即三陰型乳腺癌，其組織學(xué)、臨床生物學(xué)行為、分子生物學(xué)方面與其它乳腺癌類型不同。由于p53和BRCA基因功能喪失或降低，易在DNA修復(fù)中發(fā)生錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致基因的高度不穩(wěn)定；惡性度、侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率均相對較高［15］。內(nèi)分泌治療及針對 HER-2的靶向治療均不適合于三陰型乳腺癌，對藥物的治療效果較差。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三陰型乳腺癌患者中PD-L1、PD-L2高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示 PD-L1、PD-L2可能在乳腺癌患者中抑制 T細(xì)胞免疫，阻斷這一信號(hào)途徑有可能改善三陰型乳腺癌患者的治療效果，提高患者5年生存期。

表3 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌 PD-L1、PD-L2的表達(dá)和 ER、PR、HER-2的相關(guān)性分析

總之，人乳腺癌癌細(xì)胞及局部間質(zhì)細(xì)胞異常表達(dá) PD-L1和 PD-L2，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。通過干預(yù)這些負(fù)性調(diào)控分子介導(dǎo)的信號(hào)通路，有望成為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。

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PD-L1 and PD-L2 expressions in human breast cancer and their significance

GENGWei-pu
（Department of Pathology，Henan Traditional Chinese Medicine Hospital／the Second Affiliated Hospital of Henan TCM University，Zhengzhou 450002，China）

PurposeTo investigate the expressions of costimulationmolecules PD-L1 and PD-L2 in human breast cancers and their association with clinical and pathologic characteristics of the patients.MethodsThe expressions of PD-L1，PDL2 in 10 cases of normal human breast tissue，18 cases of ductal carcinoma in situ，and 40 cases of breast cancer were detected by immunohistochemistry SP two-step staining，and the relationship between their expressions and clinical and pathologic characteristics was evaluated.ResultsTherewas no PD-L1 or PDL2 expression in normal breast tissue，faint expressions of PDL1 and PD-L2 were determined in ductal carcinoma in situ. 45% （18／40）PD-L1 and 35% （14／40）PD-L2 were detected in breast cancers.PD-L1 and PD-L2 expression in cancer cells were related to the lymph node metastasis，ER and PR（P＜0.05）.High expression of PD-L1 and PD-L2 in breast cancer patients were correlated with negative ER，PR and HER-2（P＜0.05）.ConclusionPD-L1 and PD-L2 express aberrantly in breast cancer and are closely associated with the lymph nodemetastasis of breast cancer.PD-L1 and PD-L2 may be the potential immunotherapy targets of breast cancer.

breast neoplasm；PD-L1；PD-L2；immunohistochemistry

R 737.9

A

1001－7399（2017）01－0059－04

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.015

接受日期：2016－12－16

河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）病理科，鄭州 450002

耿衛(wèi)樸，女，碩士研究生。E-mail：gwp20092009＠163.com