鄭 麗，趙 敏，昂 琳，黃 金，王 瑾，鄒 強(qiáng)，吳正升

乳腺癌中BCL-6和ZEB2的表達(dá)及其意義

鄭 麗1，趙 敏1，昂 琳1，黃 金1，王 瑾1，鄒 強(qiáng)1，吳正升2

目的探討 BCL-6和 ZEB2在乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的生物學(xué)意義。方法分別采用免疫組化 SP兩步法與原位雜交法檢測(cè)228例乳腺癌和80例乳腺良性病變組織中BCL-6、ZEB2蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果乳腺癌組織中 BCL-6、ZEB2蛋白及 mRNA表達(dá)水平均顯著高于乳腺良性病變組織（P＜0.05）；BCL-6表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期及 HER-2表達(dá)均呈正相關(guān)（P＜0.05）；ZEB2表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及 HER-2表達(dá)均呈正相關(guān)（P＜0.05）；乳腺癌中 BCL-6、ZEB2陽(yáng)性者總生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期均顯著低于陰性者（P＜0.01）。結(jié)論BCL-6、ZEB2與乳腺癌演進(jìn)過(guò)程密切相關(guān)，檢測(cè) BCL-6和ZEB2的表達(dá)，有望成為監(jiān)測(cè)與預(yù)警乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要手段。

乳腺腫瘤；BCL-6；ZEB2；免疫組織化學(xué)；原位雜交

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因。建立有效的監(jiān)測(cè)和預(yù)警乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的手段，及早進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)治療，對(duì)改善患者預(yù)后及提高患者生活質(zhì)量具有十分重要的意義。腫瘤細(xì)胞上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在乳腺惡性腫瘤演進(jìn)過(guò)程中發(fā)揮主要作用，多種調(diào)控因子參與EMT的發(fā)生，如ZEB1、 ZEB2、TGFβ、VEGF等。有文獻(xiàn)報(bào)道［1］BCL-6也可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生 EMT。本文分別采用免疫組化 SP兩步法和原位雜交法檢測(cè)乳腺癌及乳腺良性病變組織中BCL-6、ZEB2蛋白及mRNA的表達(dá)，探討兩者在乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料選取合肥市第二人民醫(yī)院病理科和安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 2004年 5月 ～2014年11月手術(shù)切除的女性浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本228例?；颊吣挲g33～83歲，中位年齡58歲；根據(jù)WHO（2012）乳腺腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級(jí) 19例、Ⅱ級(jí)141例、Ⅲ級(jí)68例；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟 TNM乳腺腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期9例、Ⅱ期110例、Ⅲ期98例、Ⅳ期 11例?；颊咝g(shù)前均未接受過(guò)放、化療或免疫治療，其中197例患者具有完整的生存隨訪資料，中位隨訪時(shí)間為60個(gè)月。另收集同期手術(shù)切除的女性乳腺良性病變組織80例（其中乳腺腺病41例、乳腺纖維腺瘤33例、乳腺導(dǎo)管上皮普通型增生6例）；年齡16～58歲，中位年齡37歲。

1.2 試劑

1.2.1 免疫組化試劑 兔抗人多克隆抗體BCL-6（濃縮型）及鼠抗人單克隆抗體ZEB2（濃縮型）均購(gòu)自美國(guó)Rockville公司。ER、PR、CerbB-2、SP免疫組化檢測(cè)試劑盒及 DAB顯色液等均購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物公司。

1.2.2 原位雜交試劑 BCL-6及ZEB2 mRNA原位雜交檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司。所用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針序列如下，BCL-6：5′-GACAGCTGTATCCAGTTCACCCGCCATGCCAGTGA-3′，5′-TTCTATAGCATCTTTACAGACCAGTTGAAATGCA A-3′，5′-ATCCTGCAGATGGAGCATGTTGTGGACAG TTGCCG-3′；ZEB2：5′-TACTATGCTATGAACATGGA GCCCAACTCCGATGA-3′，5′-AAGGAATTTTCAAATTCAAATAATCTGGACAACAA-3′，5′-ATGAACCGGG CTTACTTGCAGAGCATTACCCCTCA-3′。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測(cè) BCL-6、ZEB2蛋白的表達(dá)

采用免疫組化 SP兩步法檢測(cè)BCL-6、ZEB1蛋白在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達(dá)。BCL-6抗體使用濃度為1∶100，ZEB2抗體使用濃度為 1∶100。選用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2 原位雜交檢測(cè) BCL-6、ZEB2 mRNA表達(dá)切片經(jīng)脫蠟、水化、3%過(guò)氧化氫孵育、胃蛋白酶消化等一系列處理后，滴加地高辛標(biāo)記的BCL-6或ZEB2探針，40℃恒溫雜交 20 h，生物素化鼠抗地高辛抗體37℃溫浴1 h，鏈霉親和素生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC）孵育后DAB液顯色。使用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，探針稀釋液代替探針作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定BCL-6和ZEB2蛋白染色均主要以細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色判定為陽(yáng)性著色。BCL-6和ZEB2 mRNA染色也以細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色判定為陽(yáng)性著色。每張切片均選取 5個(gè)400倍高倍視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)百分比：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%，判定為陰性；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%，判定為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用χ2檢驗(yàn)比較樣本陽(yáng)性率之間的差異；采用 Kaplan-Meier生存曲線法及 Log-rank檢驗(yàn)比較組間生存率；采用非參數(shù) Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析陽(yáng)性率與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 BCL-6和 ZEB2在乳腺癌及乳腺良性病變中的表達(dá)

2.1.1 BCL-6和 ZEB2蛋白的表達(dá) 228例乳腺癌中125例BCL-6蛋白呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為54.8%；80例乳腺良性病變中28例BCL-6蛋白呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為35.0%。BCL-6蛋白在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達(dá)差異有顯著性（P＜0.05，表1，圖1）。228例乳腺癌中 126例 ZEB2蛋白呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為55.3%；80例乳腺良性病變中26例 ZEB2蛋白呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為32.5%。ZEB2蛋白在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達(dá)差異有顯著性（P＜0.05，表1，圖2）。

表1 BCL-6和 ZEB2蛋白在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達(dá)

2.1.2 BCL-6和 ZEB2 mRNA的表達(dá) 228例乳腺癌中123例BCL-6 mRNA呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為53.9%（圖3）；80例乳腺良性病變中25例BCL-6 mRNA呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為31.3%。BCL-6 mRNA在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達(dá)差異有顯著性（P＜0.05，表2）。228例乳腺癌中119例 ZEB2 mRNA呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為52.2%（圖 4）；80例乳腺良性病變中26例ZEB2 mRNA呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為32.5%。ZEB2 mRNA在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達(dá)差異有顯著性（P＜0.05，表2）。

表2 BCL-6和ZEB2 mRNA在乳腺癌和乳腺良性病變中的表達(dá)

2．2 BCL-6和 ZEB2表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征及ER、PR、HER-2相關(guān)性分析乳腺癌中BCL-6蛋白表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期及 HER-2表達(dá)狀況均呈正相關(guān)（P＜0.05），與患者年齡及ER、PR表達(dá)狀況均無(wú)相關(guān)性；ZEB2蛋白表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及HER-2表達(dá)均呈正相關(guān)（P＜0.05，表3），與患者年齡、組織學(xué)分級(jí)及ER、PR表達(dá)均無(wú)相關(guān)性。

圖1 BCL-6蛋白在乳腺癌中的表達(dá)，SP兩步法 圖2 ZEB2蛋白在乳腺癌中的表達(dá)，SP兩步法 圖3 BCL-6 mRNA在乳腺癌中的表達(dá)，原位雜交法 圖4 ZEB2 mRNA在乳腺癌中的表達(dá)，原位雜交法

2．3 BCL-6與 ZEB2表達(dá)與乳腺癌患者生存率的關(guān)系采用Kaplan-Meier生存曲線法及Log-rank檢驗(yàn)分析乳腺癌中 BCL-6和ZEB2蛋白表達(dá)與患者總生存率（overall survival，OS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存率（root file system，RFS）的相關(guān)性。BCL-6蛋白陽(yáng)性的乳腺癌患者 RFS和 OS均顯著低于其陰性乳腺癌患者（P＝0.002，P＝0.001）。ZEB2蛋白陽(yáng)性的乳腺癌患者RFS和OS亦顯著低于其陰性乳腺癌患者（P＝0.003，P＝0.001，圖5）。

2．4 乳腺癌中 BCL-6、ZEB2表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析表明，BCL-6蛋白表達(dá)與 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)性（r＝0.721，P＜0.01），ZEB2蛋白表 達(dá) 與 mRNA表 達(dá) 呈 正相 關(guān)性 （r＝0.747，P＜ 0.01）；BCL-6蛋白表達(dá)與 ZEB2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.669，P＜0.01），BCL-6 mRNA表達(dá)與 ZEB2 mRNA表達(dá)亦呈正相關(guān)（r＝0.382，P＜0.01）。

表3 BCL-6和 ZEB2蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

BCL-6屬于BTB／POZ轉(zhuǎn)錄因子家族，編碼核轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，主要功能是抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，阻止細(xì)胞分化、凋亡，促進(jìn)其發(fā)育、增殖。BCL-6是淋巴系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)的重要因子之一，既往研究［2－3］發(fā)現(xiàn) BCL-6在生發(fā)中心B細(xì)胞和生發(fā)中心來(lái)源的 B細(xì)胞淋巴瘤中高表達(dá)。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道BCL-6在乳腺癌組織中也呈陽(yáng)性，并與腫瘤分化、進(jìn)展密切相關(guān)，在乳腺癌分子靶向治療中可能具有潛在價(jià)值。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道［4－7］BCL-6在乳腺癌組織中高表達(dá)，隨腫瘤進(jìn)展而表達(dá)上調(diào)，Pinto等［8］則指出 BCL-6蛋白在乳腺癌原發(fā)灶中陽(yáng)性，而在復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的乳腺癌中表達(dá)缺失，與前者結(jié)論不同。本組中BCL-6在乳腺癌組織中與乳腺良性病變組織中的表達(dá)差異有顯著性，乳腺癌組織中BCL-6明顯高表達(dá)，與先前報(bào)道結(jié)果較一致，且 BCL-6蛋白表達(dá)與 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。乳腺癌中BCL-6蛋白表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期和 HER-2表達(dá)均呈正相關(guān)；而腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況均是乳腺癌TNM分期的重要因素，TNM分期和組織學(xué)分級(jí)又與腫瘤生物學(xué)行為、預(yù)后密切相關(guān)，分級(jí)、分期越高者，腫瘤進(jìn)展程度越高、預(yù)后越差；乳腺癌 HER-2陽(yáng)性者，腫瘤細(xì)胞惡性程度亦更高，提示 BCL-6在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)的生存率分析結(jié)果顯示，乳腺癌患者中BCL-6陽(yáng)性者OS 及 RFS均顯著低于 BCL-6陰性者，提示 BCL-6與乳腺癌預(yù)后密切相關(guān)。

圖5 乳腺癌中 BCL-6、ZEB2蛋白的生存曲線圖

A.BCL-6表達(dá)與 RFS；B.BCL-6表達(dá)與 OS；C.ZEB2表達(dá)與RFS；D.ZEB2表達(dá)與OS

ZEB2可通過(guò)與E-基因的啟動(dòng)子上結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生，從而增強(qiáng) 腫瘤 的 侵襲、轉(zhuǎn)移 能 力［9－11］。有 研 究發(fā) 現(xiàn)，ZEB2在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)，且表達(dá)水平與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［12］；Si等［13］指出，ZEB2可通過(guò)與GATA3的循環(huán)反饋?zhàn)饔枚种坪宿D(zhuǎn)錄，進(jìn)一步誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。本組乳腺癌中ZEB2蛋白及 mRNA表達(dá)均顯著高于乳腺良性病變，且乳腺癌中 ZEB2蛋白表達(dá)與 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，推測(cè) ZEB2可能參與乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展。隨著腫瘤直徑的增大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生和 TNM分期的增高，ZEB2蛋白陽(yáng)性率均明顯增高；HER-2高表達(dá)者，ZEB2陽(yáng)性率亦顯著增高，進(jìn)一步證實(shí)ZEB2在乳腺癌進(jìn)展中的推動(dòng)作用。ZEB2高表達(dá)的乳腺癌患者OS及RFS均顯著降低，證實(shí)ZEB2表達(dá)與乳腺癌預(yù)后相關(guān)。

綜上所述，本組結(jié)果提示BCL-6和ZEB2是乳腺癌惡性演進(jìn)過(guò)中的兩項(xiàng)重要因子，檢測(cè) BCL-6、ZEB2表達(dá)有望成為監(jiān)測(cè)與預(yù)警乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要手段。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中BCL-6與ZEB2蛋白表達(dá)、BCL-6與ZEB2 mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)，提示 BCL-6與 ZEB2在乳腺癌的演進(jìn)過(guò)程中可能具有某種相互促進(jìn)作用，但具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步分析。

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Expression and significance of BCL-6 and ZEB2 in breast cancer

ZHENG Li1，ZHAO Min1，ANG Lin1，HUANG Jin1，WANG Jin1，ZOU Qiang1，WU Zheng-sheng2
（1Department of Pathology，the Second People’s Hospital of Hefei，Hefei 230011，China；2Department of Pathology，AnhuiMedical University，Hefei 230032，China）

PurposeTo explore the biological significance of BCL-6 and ZEB2 in invasion，metastasis and prognosis of breast cancer.M ethodsThe expressions of BCL-6，ZEB2 protein andmRNA were detected respectively in 228 cases of breast cancer and 80 cases of breast benign lesions by immunohistochemical SP two-step staining and situ hybridization.ResultThe expression levels of BCL-6，ZEB2 protein and mRNA in breast cancer tissueswere significantly higher than in breast benign lesions（P＜0.05）.The expressions of BCL-6 was positively correlated with tumor size，lymphaticmetastasis，histological grade，TNM staging and HER-2 expression（P＜0.05）. The expressions of ZEB2 was positively correlated with tumor size，lymphatic metastasis，TNM staging and HER-2 expression （P＜0.05）.The overall survival and relapse-free survival of BCL-6 and ZEB2 positive expression were significantly less than the negative expression（P＜0.01）.ConclusionThe BCL-6 and ZEB2 are closely correlated with the evolution process of breast cancer，which may become importantmeans for monitoring and warning the metastasis，invasion，and prognosis of breast cancer.

breast neoplasm；BCL-6；ZEB2；immunohistochemisty；situ hybridization

R 737.9

A

1001－7399（2017）01－0050－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.013

接受日期：2016－11－21

合肥市自主創(chuàng)新政策“借轉(zhuǎn)補(bǔ)”項(xiàng)目［合科（2014）71號(hào)］

1合肥市第二人民醫(yī)院病理科，合肥 230011

2安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 230032

鄭 麗，女，碩士研究生，醫(yī)師。E-mail：zhengli352＠163. com

趙 敏，女，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail：zhao.min.hi＠163.com