陳兆亮+康珍

摘 要 基因編輯技術(shù)是對(duì)基因組進(jìn)行精確定點(diǎn)改造的一項(xiàng)新技術(shù)，同時(shí)也是研究基因生物功能的一個(gè)有力工具。經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展，目前主要有鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶和RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas核酸酶技術(shù)三種新型的基因編輯技術(shù)。綜述了三種技術(shù)的結(jié)構(gòu)原理和作用機(jī)理，并對(duì)基因編輯技術(shù)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 基因編輯 鋅指核酸酶 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 CRISPR/Cas9核酸酶

中圖分類號(hào) Q-49 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 E

基因編輯是指對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的一項(xiàng)新技術(shù)。利用該技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點(diǎn)上，在這位點(diǎn)上剪斷靶標(biāo)DNA片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變，又修改并編輯了原有的基因組，真正達(dá)成了“編輯基因”。

1 研究背景

近年來，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，研究人員正通過定點(diǎn)突變的方法使目的基因完全失活來研究特定基因的功能，這是一種最直接有效的研究方法。隨著高特異性及更具操作性的人工核酸酶的出現(xiàn)和技術(shù)體系的完善，基因編輯技術(shù)獲得了飛速發(fā)展，并將靶向基因操作推向高潮，使得定點(diǎn)基因敲除、敲入變得更為簡單且高效。與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細(xì)胞（ES）技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)保留了可定點(diǎn)修飾的特點(diǎn)，并應(yīng)用到更多的物種上，效率更高，構(gòu)建時(shí)間更短，成本更低。

2 基因編輯原理

現(xiàn)代基因編輯技術(shù)的基本原理是相同的，即借助特異性DNA雙鏈斷裂（DSB）激活細(xì)胞的天然修復(fù)機(jī)制，包括非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復(fù)（HDR）兩條途徑。

2.1 非同源末端連接

非同源末端連接是一種低保真度的修復(fù)過程，斷裂的DNA修復(fù)重連的過程中會(huì)發(fā)生堿基隨機(jī)地插入或丟失，造成移碼突變，使基因失活，實(shí)現(xiàn)目的基因敲除。如果一個(gè)外源性供體基因序列存在，NHEJ機(jī)制會(huì)將其連入雙鏈斷裂DSB位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的基因敲入。

2.2 同源重組修復(fù)

同源重組修復(fù)是一種相對(duì)高保真度的修復(fù)過程，在一個(gè)帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會(huì)通過同源重組過程完整地整合到靶位點(diǎn)，不會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)的堿基插入或丟失。若在一個(gè)基因兩側(cè)同時(shí)存在DSB及同源供體的情況下，可以進(jìn)行原基因的替換。

3 基因編輯技術(shù)的種類

目前主要有3種基因編輯技術(shù)，分別為人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)；轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)；RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas核酸酶技術(shù)（CRISPR/Cas RGNs）。

3.1 ZFN基因組編輯技術(shù)

ZFN技術(shù)是第一代基因編輯技術(shù)，是基于鋅指蛋白發(fā)展起來的。1986年，Diakun等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2/His2鋅指模塊。1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對(duì)由4個(gè)鋅指連接而成的ZFN，可識(shí)別24 bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因編輯中的應(yīng)用。

ZFN由鋅指蛋白（ZFP）和FokⅠ核酸內(nèi)切酶組成。其中，由ZFP構(gòu)成的DNA識(shí)別域能識(shí)別DNA特異位點(diǎn)并與之結(jié)合，而由FokⅠ構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點(diǎn)的雙鏈DNA斷裂。于是，細(xì)胞可以通過同源重組修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接修復(fù)機(jī)制來修復(fù)DNA。HDR修復(fù)有可能會(huì)對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而NHEJ修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，由此達(dá)到基因敲除的目的。

ZFN誘導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點(diǎn)的編譯，具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但是目前?個(gè)缺陷制約了該技術(shù)的推廣：① 以現(xiàn)有的策略設(shè)計(jì)高親和性的ZFN，需投入大量的工作和時(shí)間；② 在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)ZFN對(duì)細(xì)胞有毒性；③ 雖然三聯(lián)體設(shè)計(jì)具有一定特異性，但仍存在不同程度的脫靶效應(yīng)。

3.2 TALEN基因組編輯技術(shù)

2009年，研究者在植物病原體黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活子樣因子效應(yīng)物，是特異識(shí)別DNA序列的基礎(chǔ)。TALEN識(shí)別模塊一般由34個(gè)氨基酸組成，其中第12、13位氨基酸高度可變，被稱為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基（RVD）。RVD決定了對(duì)特異性核苷酸的識(shí)別，其與A、G、C、T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，如即NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，HD識(shí)別C，NN識(shí)別G。隨后，TALEN特異識(shí)別DNA序列的特性被用來取代ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它的可設(shè)計(jì)性更強(qiáng)，不受上下游序列的影響，具備比ZFN更廣闊的應(yīng)用潛力。

TALEN包含2個(gè)TALEN蛋白，每個(gè)TALEN都是由TALE array與FokⅠ融合而成。在進(jìn)行基因編輯時(shí)，其中一個(gè)TALEN靶向正義鏈上的靶位點(diǎn)，另一個(gè)則靶向反義鏈上的靶位點(diǎn)。然后FokⅠ形成二聚體，在靶向序列中間的spacer處切割DNA，造成雙鏈DNA斷裂，隨后細(xì)胞啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，F(xiàn)okⅠ針對(duì)不同的TALEN骨架，其最適宜的spacer長度不同，其長度范圍一般為12～20 bp。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TALEN在靶向DNA時(shí)，第一個(gè)堿基為T時(shí)其結(jié)合效果更佳。

目前，TALEN已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、哺乳動(dòng)物和植物的特異性位點(diǎn)來進(jìn)行基因打靶，與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，但仍然有些問題需要解決，例如脫靶效應(yīng)、TALEN與基因組進(jìn)行特異結(jié)合受鄰近序列影響等。

3.3 CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是最近生命科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)話題，該項(xiàng)技術(shù)的興起使基因編輯領(lǐng)域得到飛躍發(fā)展。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)源于對(duì)細(xì)菌與古生菌的研究。早在1987年，日本的研究人員發(fā)現(xiàn)E.coli中存在一些29 bp的重復(fù)序列，但他們當(dāng)時(shí)并不清楚這些序列的具體功能，經(jīng)過幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復(fù)序列與細(xì)菌的獲得性免疫有關(guān)。

2002年，Jansen等將這些間隔排列的重復(fù)序列命名為CRISPR，并且鑒定出了與CRISPR序列位于同一基因簇的CRISPR相關(guān)蛋白Cas，同時(shí)將CRISPR基因簇分為三個(gè)不同的類型（Ⅰ型、Ⅱ型與Ⅲ型），在三種不同類型的CRISPR系統(tǒng)中，Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)最為簡單。

CRISPR/Cas9為一種可編輯的短RNA介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，由Cas9核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成。轉(zhuǎn)錄的sgRNA折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與Cas9蛋白形成復(fù)合體，指導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶識(shí)別特定靶位點(diǎn)，在間隔序列毗鄰區(qū)（PAM）序列上游切割DNA，造成雙鏈DNA斷裂，并啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制。

經(jīng)研究，從不同菌種中分離的CRISPR/Cas系統(tǒng)，其CrRNA（或者是人工構(gòu)建的sgRNA）靶向序列的長度不同，PAM序列也可能不同。

4 基因編輯技術(shù)的展望

隨著越來越多物種基因組測序的完成，基因功能的研究成為后基因時(shí)代的重點(diǎn)?；蚓庉嫾夹g(shù)既可以用正?；蛱娲蛔兓蜻M(jìn)行性狀改良和基因治療，也可以用突變基因代替正?；蜻M(jìn)行基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯技術(shù)擺脫了對(duì)ES細(xì)胞的限制，可以應(yīng)用于更多的物種，且定向修飾更加精確，效率更高，所需時(shí)間更短，得到的突變可以通過種系遺傳。其中，CRISPR系統(tǒng)可以同時(shí)進(jìn)行多靶點(diǎn)的切割，易于得到純合子突變體。

伴隨基因編輯技術(shù)的發(fā)展，與之相關(guān)的多基因連接策略，表達(dá)調(diào)控策略等配套技術(shù)體系正在形成，為今后大規(guī)模，多基因動(dòng)物的改良奠定了基礎(chǔ)。更多基因組編輯畜禽的出現(xiàn)會(huì)給畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)，人類營養(yǎng)水平和生活質(zhì)量帶來革命性地影響?？梢灶A(yù)見，以基因編輯技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)將進(jìn)入黃金時(shí)期。

總之，基因編輯技術(shù)的研發(fā)還處于起步階段，但其已表現(xiàn)出的相對(duì)于基因打靶技術(shù)的優(yōu)勢(shì)已十分明顯。在未來的發(fā)展中，基因編輯技術(shù)必將成為生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究與應(yīng)用的重要工具。

參考文獻(xiàn)：

[1] Miller J C， Holmes M C， Wang J， et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing[J]. Nature biotechnology， 2007，25（7）： 778-785.

[2] Beerli R R， Barbas C F.Engineering polydactyl zinc-finger transcription factors[J]. Nature biotechnology， 2002，20（2）： 135-141.

[3] Miller J C， Tan S， Qiao G， et al.A TALE nuclease architecture for efficient genome editing[J].Nature biotechnology，2011， 29（2）： 143-148.

[4] Streubel J， Blücher C， Landgraf A， et al.TAL effector RVD specificities and efficiencies[J]. Nature biotechnology，2012，30（7）： 593-595.

[5] Cermak T， Doyle E L， Christian M， et al.Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting[J].Nucleic acids research，2011.

[6] Ishino Y， Shinagawa H， Makino K， et al.Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product[J]. Journal of bacteriology，1987，169（12）： 5429-5433.