蔡樂(lè)+曹秋娥+韋琨+丁中濤

[摘要]本文以蘭科植物蘚葉卷瓣蘭中分離得到的一個(gè)新化合物retusiusine A的綜合解析為例，講授研究生課程《物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定與表征》中的核磁共振（nuclear magnetic resonance）波譜分析內(nèi)容。retusiusine A結(jié)構(gòu)中包含苯環(huán)、含氧取代碳和不含氧取代碳，而且其核磁數(shù)據(jù)不重疊，非常適合作為核磁共振授課內(nèi)容。

[關(guān)鍵詞]核磁共振；retusiusine A；《物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定與表征》

[中圖分類號(hào)] G642.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）01（c）-0143-06

[Abstract]This paper describes the teaching of graduate student curriculum “Materia structural identification and characterization” through the NMR analysis of retusiusine A，which is a new compound isolated from Bulbophyllum retusiusculum.Retusiusine A contains benzene，oxygenated carbon and non-oxygenated carbon，and its NMR data are non-overlapped and very suitable for NMR teaching content.

[Key words]Nuclear magnetic resonance；retusiusine A；Material structure identification and characterization

《核磁共振波譜》課程是有機(jī)化學(xué)、藥物化學(xué)和天然藥物化學(xué)等相關(guān)專業(yè)的一門重要課程[1-2]，很多高校教師一直在探索該課程的教學(xué)改革，包括網(wǎng)絡(luò)教學(xué)[3]、互動(dòng)教學(xué)[4]、注重實(shí)踐[5]、結(jié)合實(shí)驗(yàn)[6]和考試改革[7]等。云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院針對(duì)研究生開(kāi)設(shè)了類似必修課程《物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定與表征》，與很多學(xué)校一樣[8-9]，要讓課程背景不同的研究生同步學(xué)習(xí)這門課程是教學(xué)的難點(diǎn)。筆者認(rèn)為，如果能以綜合解析為主，在解析過(guò)程中強(qiáng)化核磁共振（NMR）基本內(nèi)容，將有望滿足不同課程背景的研究生對(duì)該門課程的需求。

核磁共振主要內(nèi)容包括氫譜（1H NMR）、碳譜（13C NMR）、DEPT譜和二維譜，二維譜主要又包括HSQC、HMBC、1H-1H COSY和ROESY等四種圖譜。本文以蘭科植物蘚葉卷瓣蘭中分離得到的一個(gè)新化合物retusiusine A（圖1）[10]的綜合解析為例，來(lái)講授《物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定與表征》課程?；衔飏etusiusine A的NMR數(shù)據(jù)包括苯環(huán)、含氧取代和不含氧取代的信號(hào)，而且數(shù)據(jù)不重疊，非常適合作為核磁共振波譜分析課程授課內(nèi)容。

1 1H NMR

1H NMR譜提供的最重要的三個(gè)信息是化學(xué)位移（反映氫的化學(xué)環(huán)境，與電子云密度有關(guān)）、偶合常數(shù)（反映氫的空間關(guān)系）和氫的數(shù)量（與氫的峰面積積分相關(guān)）。

1.1化學(xué)位移

學(xué)生要記住，氫（碳）周圍的電子云密度越大，其化學(xué)位移越出現(xiàn)在高場(chǎng)，電子云密度越低，化學(xué)位移越往低場(chǎng)。從retusiusine A的1H NMR譜（圖1）可以看到該化合物的兩個(gè)1，3，4-三取代苯環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)，這六個(gè)氫均位于苯環(huán)氫δ7.25附近，在此處可以介紹三類主要的取代基對(duì)苯環(huán)氫化學(xué)位移的影響，①烷基：比如C-7′，這類取代基對(duì)苯環(huán)氫化學(xué)位移基本沒(méi)有影響，原因是既不產(chǎn)生共軛效應(yīng)也不產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)。②羰基：羰基與苯環(huán)存在共軛效應(yīng)，且由于氧的電負(fù)性使苯環(huán)電子云去屏蔽，導(dǎo)致苯環(huán)電子云密度降低，H-2（H-2′）和H-6受到的去屏蔽影響最大，H-6′處在羰基對(duì)位，受到的去屏蔽作用次之，而H-5（H-5′）反而受到了一定的屏蔽作用（圖2A）[11]，基于這個(gè)影響，化學(xué)位移應(yīng)該是H-2=H-6>H-5（H-2′>H-6′> H-5′）。③含氧取代基（羥基和甲氧基）：氧的孤對(duì)電子會(huì)與苯環(huán)形成共軛，從而使苯環(huán)受到屏蔽，導(dǎo)致電子云密度上升，含氧取代基對(duì)其鄰位氫的屏蔽作用最大，對(duì)對(duì)位氫的屏蔽其次，而對(duì)間位氫的影響最?。▓D2B、圖2C）[12]?；诖?，H-2受到一個(gè)鄰位氧和一個(gè)間位氧的屏蔽，H-5受到一個(gè)鄰位氧和一個(gè)間位氧的屏蔽，H-6受到一個(gè)對(duì)位氧和一個(gè)間位氧的屏蔽，如果僅看氧的影響，化學(xué)位移應(yīng)該是H-6>H-5=H-2，綜合羰基和烷基的影響，結(jié)果就是H-6>H-2>H-5。另一個(gè)苯環(huán)上，H-5′受到一個(gè)鄰位氧的屏蔽，H-2′和H-6′受到一個(gè)間位氧的屏蔽，如果只考慮氧的影響，化學(xué)位移應(yīng)該是H-2′=H-6′>H-5′，綜合羰基和烷基的影響，結(jié)果應(yīng)該為H-2′>H-6′>H-5′。以上分析與圖譜吻合，這樣分析化學(xué)位移，結(jié)合峰形，對(duì)于學(xué)生歸屬1H NMR數(shù)據(jù)很有幫助，也可加深學(xué)生對(duì)共軛效應(yīng)的理解和記憶。

H-8′由于受氧的誘導(dǎo)效應(yīng)，加上旁邊C-9′羰基的各向異性效應(yīng)的影響，出現(xiàn)在δ5.0左右（實(shí)為δ5.33），H-7′沒(méi)有與雜原子相連，只有到O-8′的弱誘導(dǎo)效應(yīng)（誘導(dǎo)效應(yīng)隨距離增加下降很快），和苯環(huán)的各向異性效應(yīng)影響，兩個(gè)氫的化學(xué)位移出現(xiàn)在δ3.22和δ3.27。一個(gè)CH2上的兩個(gè)氫的化學(xué)位移出現(xiàn)在不同位置的原因是該CH2與手性碳相連（C-7′）。甲氧基的化學(xué)位移在δ3.1～4.0，與苯環(huán)相連的甲氧基由于苯環(huán)的各向異性效應(yīng)要更低場(chǎng)一些，可到δ3.6～4.0，OCH3-3和OCH3-4的實(shí)際化學(xué)位移在δ3.84和δ3.86，符合以上分析。retusiusine A的1H NMR全數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1。

1.2偶合常數(shù)

偶合常數(shù)就是峰裂開(kāi)的距離，以J來(lái)表示，單位為Hz，它反映兩個(gè)核之間的作用強(qiáng)弱，影響偶合常數(shù)的因素主要有偶合核間的距離、角度及電子云密度。H-5（H-5′）只與H-6（H-6′）發(fā)生J3偶合，故其峰形為標(biāo)準(zhǔn)的二重峰（圖2），苯環(huán)的J3偶合常數(shù)一般為8.0 Hz左右（實(shí)際為8.4 Hz）。H-2（H-2′）只與H-6（H-6′）發(fā)生J4偶合，一般J4偶合的偶合常數(shù)一般在1.5～2.5 Hz，H-2（H-2′）的實(shí)際偶合常數(shù)為1.6 Hz。H-6（H-6′）則除了與H-5（H-5′）發(fā)生J3偶合，還與H-2（H-2′）發(fā)生J4偶合，故峰形為雙二重峰，偶合常數(shù)為8.4和1.6 Hz。H-8′分別與磁不等價(jià)的H-7′a和H-7′b偶合，故峰形為雙二重峰，偶合常數(shù)為4.6 Hz和7.2 Hz。H-7′a與H-7′b和H-8′偶合，因此峰形也為雙二重峰，偶合常數(shù)為4.6 Hz和14.4 Hz。同樣的，H-7′b也為雙二重峰，偶合常數(shù)為7.2和14.4 Hz。甲氧基因鄰位（氧）沒(méi)有氫取代故為單峰。

1.3氫的數(shù)量

從每一個(gè)氫的積分面積可以看出，積分面積與氫的數(shù)量成正比，其中甲氧基的氫的積分面積表明每一個(gè)甲氧基有三個(gè)氫。

2 13C NMR和DEPT

2.1 13C NMR

每一個(gè)碳都會(huì)在13C NMR譜中出現(xiàn)一個(gè)信號(hào)，retusiusine A中的19個(gè)碳信號(hào)均在13C NMR譜中出現(xiàn)（圖3）。13C NMR譜中羧基的化學(xué)位移在最低場(chǎng)，分別出現(xiàn)在δ172.9和δ173.3，酯基的化學(xué)位移稍高，出現(xiàn)在δ167.0。苯環(huán)碳的化學(xué)位移一般出現(xiàn)在δ128附近，C-4′因?yàn)槭艿窖醯恼T導(dǎo)效應(yīng)出現(xiàn)在δ162.2，C-3和C-4同樣受到氧的誘導(dǎo)效應(yīng)，但是因?yàn)閮蓚€(gè)碳都受到鄰位氧的屏蔽作用（與氫類似），因此化學(xué)位移出現(xiàn)在δ150.1和δ155.0。C-2′和C-6′受到羰基-10′的去屏蔽效應(yīng)，化學(xué)位移出現(xiàn)在稍低場(chǎng)大于δ128的位置，即δ132.5和δ137.9。C-2、C-5和C-5′均受到鄰位氧的屏蔽作用，化學(xué)位移出現(xiàn)在稍高場(chǎng)小于δ128的位置，分別是δ113.2、δ111.8和δ118.2。C-6既受到羰基-7的去屏蔽作用，也受到OCH3-3的對(duì)位屏蔽，出現(xiàn)在δ125.2。C-8′受到氧的誘導(dǎo)效應(yīng)，出現(xiàn)在δ74.4，C-7′未受到誘導(dǎo)效應(yīng)（或者J3誘導(dǎo)效應(yīng)較弱），出現(xiàn)在δ37.8。retusiusine A的13C NMR數(shù)據(jù)全歸屬見(jiàn)表1。

2.2 DEPT

DEPT譜主要反映碳的級(jí)數(shù)，即可以通過(guò)DEPT譜區(qū)分C、CH、CH2和CH3。相對(duì)13C NMR譜，DEPT 135譜中消失的是季碳，向下的是CH2，向上的是CH和CH3，DEPT 90譜中只有向上的CH（圖3）。學(xué)生對(duì)DPET的要求就只需要知道這個(gè)區(qū)分方法就可以了。通過(guò)對(duì)實(shí)際譜圖的學(xué)習(xí)也能非常明了地向?qū)W生介紹DEPT譜解析方法。

3二維核磁共振譜

3.1 1H-1H COSY譜

1H-1H COSY一般是相鄰兩個(gè)碳上的氫，或者同一個(gè)碳上化學(xué)不等價(jià)的兩個(gè)氫之間相關(guān)。在譜圖中可以看到H-7′a與H-7′b相關(guān)，H-7′a和H-7′b與H-8′相關(guān)，H-5（H-5′）與H-6（H-6′）相關(guān)（圖4）?？梢宰寣W(xué)生直觀地了解1H-1H COSY譜圖。

3.2 HSQC譜

HSQC譜反映同碳?xì)湎嚓P(guān)，在譜圖中可以看到H-2（H-2′）與C-2（C-2′）、H-5（H-5′）與C-5（C-5′）、H-6（H-6′）與C-6（C-6′）、H-7′a和H-7′b與C-7′以及H-8′與C-8′相關(guān)（圖5）。

3.3 HMBC譜

HMBC譜反映碳?xì)溥h(yuǎn)程相關(guān)，即2鍵和3鍵相關(guān)，如H-2′（H-2）與C-1′（C-1）、C-3′（C-3）、C-4′（C-4）、C-6′（C-6）、C-7′（C-7）與C-10′相關(guān)；H-5′（H-5）與C-1′（C-1）、C-3′（C-3）、C-4′（C-4）與C-6′（C-6）相關(guān)；H-6′（H-6）與C-1′（C-1）、C-2′（C-2）、C-4′（C-4）、C-5′（C-5）與C-7′相關(guān)；H-7′與C-1′、C-2′、C-6′、C-8′與C-9′相關(guān)；H-8′與C-1′、C-7′、C-9′與C-7相關(guān)（圖6）。這其中H-8′與C-7相關(guān)正是retusiusine A中兩個(gè)片段通過(guò)C（8′）-O-C（7）形成酯鍵連接的關(guān)鍵證據(jù)，文獻(xiàn)中多采用通過(guò)HMBC相關(guān)確定酯鍵或者醚鍵的連接位置[13-14]。OCH3-3與C-3相關(guān)，OCH3-4與C-4相關(guān)是甲氧基取代位置的關(guān)鍵證據(jù)。從這個(gè)圖譜可以讓學(xué)生清楚地了解HMBC譜圖在結(jié)構(gòu)解析中的強(qiáng)大功能。

3.4 ROESY譜

ROESY譜反映的是兩個(gè)氫的空間距離，對(duì)于化合物相對(duì)構(gòu)型的確立具有重要意義（圖7）。譜中H-7′a和H-7′b與H-8′，H-5（H-5′）與H-6（H-6′）的相關(guān)屬于鄰位氫相關(guān)，在結(jié)構(gòu)鑒定中意義不大。H-7′a和H-7′b與H-2′和H-6′相關(guān)，對(duì)于確定C-7′在苯環(huán)上的取代位置有一定參考意義[15]，而OCH3-3與H-2，OCH3-4與H-5的相關(guān)對(duì)于確定甲氧基的取代位置具有重要意義，很多時(shí)候比HMBC譜更為直觀[16-18]。

4教學(xué)效果

近3年來(lái)，筆者一直通過(guò)科研中遇到的真實(shí)化合物的綜合解析來(lái)講授研究生課程《物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定與表征》，通過(guò)把真實(shí)譜圖清晰地展示給學(xué)生們，讓其更容易接受教學(xué)內(nèi)容，從而提高了這門課程的實(shí)踐性。這些學(xué)生在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前已經(jīng)大量接觸實(shí)際的核磁圖譜，切實(shí)掌握了解析技巧，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后基本能夠完成常規(guī)的核磁解析工作。

綜上所述，通過(guò)化合物retusiusine A的綜合解析，可以系統(tǒng)地向?qū)W生介紹核磁共振主要譜圖的解析功能，有助于學(xué)生系統(tǒng)掌握核磁共振知識(shí)并了解其相關(guān)應(yīng)用。這種教學(xué)方式教學(xué)效果較好，更能讓學(xué)生理解該課程的意義，并通過(guò)對(duì)課程的學(xué)習(xí)養(yǎng)成良好的科研素養(yǎng)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]劉世娟.“波譜分析”課程教學(xué)方法分析與實(shí)踐[J].通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33（12）：64-67.

[2]韋國(guó)兵，楊軍，熊魏，等.藥學(xué)波譜分析精品課程內(nèi)涵建設(shè)探索與體會(huì)[J].中國(guó)教育技術(shù)裝備，2013，（11）：23-24.

[3]楊英，關(guān)瑾，耿秀娟，等.新形勢(shì)下高校波譜分析法課程的建設(shè)[J].教育教學(xué)論壇，2013，（18）：171-172.

[4]錢妍.論互動(dòng)式教學(xué)在“波譜分析”課程中的應(yīng)用[J].中國(guó)電力教育，2010，（7）：100-101.

[5]郭俊芳，郭慶中，李亮，等.材料化學(xué)專業(yè)有機(jī)波譜分析課程的教學(xué)探索[J].化工時(shí)刊，2013，27（8）：52-53.

[6]李垂明，張華，彭勤紀(jì)，等.《有機(jī)波譜分析》課程改革的探索與實(shí)踐[J].化工高等教育，2001，（l）：64-65.

[7]陸小蘭，唐洪杰，張桂玲，等.有機(jī)波譜分析課程考試模式的改革與探索[J].化工高等教育，2006，（5）：104-105.

[8]曹書(shū)霞，廖新成.波譜分析課程教學(xué)的實(shí)踐與思考[J].大學(xué)化學(xué)，2010，25（5）：36-38.

[9]許映杰，胡六江.化學(xué)/應(yīng)化專業(yè)《波譜分析》課程教學(xué)方法探討[J].紹興文理學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，32（10）：80-82.

[10]方云山.蘚葉卷瓣蘭、芳香石豆蘭和韭菜根的化學(xué)成分研究[D].昆明：云南大學(xué)，2016：11-12.

[11]Jiang B，Lin S，Zhu C，et al.Diterpenoid alkaloids from the lateral root of Aconitum carmichaelii[J].J Nat Prod，2012， 75（6）：1145-1159.

[12]趙冕，蔡樂(lè)，何健民，等.棠梨枝葉的化學(xué)成分研究[J].有機(jī)化學(xué)，2013，33（6）：1284-1290.

[13]Li ZJ，Zheng X，Wan CP，et al.A new phenolic compound with antioxidantactivity from the branches and leaves of Pyrus pashia[J].Nat Prod Res，2016，30（10）：1136-1143.

[14]Yin TP，Cai L，Li Y，et al.New alkaloids from Aconitum stapfianum[J].Nat Prod Bioprospect，2015，5（6）：271-275.

[15]Yang MH，F(xiàn)ang YS，Cai L，et al.A new flavone C-glycoside and a new bibenzylfrom Bulbophyllum retusiusculum[J].Nat Prod Res，2016，30（14）：1617-1622.

[16]Dong JW，Cai L，F(xiàn)ang YS，et al.Proaporphine and aporphine alkaloids with acetylcholinesterase inhibitory activity from Stephania epigaea[J].Fitoterapia，2015，104：102-107.

[17]馬迎聰，俞靜，王家鵬，等.韭菜根的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2016，51（12）：972-975.

[18]Yin TP，Cai L，F(xiàn)ang HX，et al.Diterpenoid alkaloids from Aconitum vilmorinianum[J].Phytochemistry，2015，116： 314-319.

（收稿日期：2016-11-21 本文編輯：許俊琴）