田岳鳳，袁 葉，王 軍，李雷勇

(1．山西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿學(xué)院，太原 030024;2．山西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，太原 030024; 3．山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，太原 030001)

針刺手厥陰經(jīng)穴對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠CRTmRNA表達(dá)率的影響*

田岳鳳1，袁 葉2，王 軍1，李雷勇3

(1．山西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿學(xué)院，太原 030024;2．山西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，太原 030024; 3．山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，太原 030001)

目的:觀察電針手厥陰經(jīng)“內(nèi)關(guān)”“郄門(mén)”穴對(duì)缺血再灌注損傷過(guò)程大鼠心肌組織CRTmRNA表達(dá)率的影響，探討經(jīng)穴與臟腑間的特異性聯(lián)系。方法:50只Wistar大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、缺血-再灌注模型組、針刺“內(nèi)關(guān)”治療組、針刺“郄門(mén)”治療組以及針刺“合谷”對(duì)照組5組各10只。除假手術(shù)組外，其他4組均制備缺血-再灌注動(dòng)物模型，假手術(shù)組穿線(xiàn)但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈?！皟?nèi)關(guān)”、“郄門(mén)”、“合谷”3組穴位針刺20 min后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支40 min，再次針刺上述穴位20 min松扎，恢復(fù)冠脈灌流60 min后摘取心臟取心尖部組織，采用RT-PCR方法測(cè)定CRTmRNA表達(dá)率，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中心電圖(ECG)全程監(jiān)測(cè)。結(jié)果:假手術(shù)組CRTmRNA的表達(dá)很低，模型組與“內(nèi)關(guān)”組、“郄門(mén)”組比較，CRTmRNA表達(dá)率下降非常明顯;模型組與“合谷”組比較，CRTmRNA表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;“內(nèi)關(guān)”組與“郄門(mén)”組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:針刺手厥陰經(jīng)穴可有效促進(jìn)CRTmRNA的表達(dá)，提高CRTmRNA的表達(dá)率，減輕胞漿鈣超載對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。

針刺;心肌缺血再灌注損傷;鈣網(wǎng)蛋白;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

心肌缺血再灌注損傷(I/R)在導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死的同時(shí)，促發(fā)凋亡細(xì)胞，凋亡的出現(xiàn)與Ca2+超載密切相關(guān)。我們以往的研究表明，針刺可明顯降低心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載的程度，抑制心肌細(xì)胞凋亡。而針刺在心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載和細(xì)胞凋亡之間的影響及作用機(jī)制一直是我們思考的問(wèn)題。本研究以往實(shí)驗(yàn)證實(shí)，針刺可明顯提高血清CRT含量，促進(jìn)CRT表達(dá)上調(diào)的基礎(chǔ)上，通過(guò)RTPCR技術(shù)檢測(cè)針刺手厥陰經(jīng)穴對(duì)心肌缺血再灌注損傷CRTmRNA表達(dá)率的影響，試圖闡明心包經(jīng)和心之間的特異性聯(lián)系，以豐富中醫(yī)學(xué)經(jīng)脈－臟腑相關(guān)理論的內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

50只清潔級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量250 g～300 g，雌雄各半，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK(晉)2009-0001)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、缺血-再灌注模型組、針刺“內(nèi)關(guān)”治療組、針刺“郄門(mén)”治療組和針刺“合谷”對(duì)照組5組各10只。

1.2 干預(yù)方法

心肌缺血再灌注損傷模型制備方法采用我們長(zhǎng)期使用經(jīng)典模型［1］。除假手術(shù)組外，其他4組均制備缺血-再灌注動(dòng)物模型，假手術(shù)組穿線(xiàn)但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈?！皟?nèi)關(guān)”“郄門(mén)”“合谷”3組穴位針刺20 min后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支40 min，再次針刺上述穴位20 min，松扎、恢復(fù)冠脈灌流60 min后，摘取心臟取心尖部組織，采用 RT-PCR方法測(cè)定CRTmRNA表達(dá)率。

1.3 儀器與試劑

采用ECG-6511心電圖機(jī)將針形電極刺于動(dòng)物皮下，接標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)，每次記錄5個(gè)心動(dòng)周期，走紙速度50mm/s，靈敏度10mm/mv，以STⅡ段變化值(結(jié)扎后ST段電位值－結(jié)扎前ST段電位值)反映心肌缺血程度。記錄結(jié)扎前、結(jié)扎后即刻、結(jié)扎后20 min、結(jié)扎后40 min、松扎后即刻、松扎后30 min、松扎后60 min 7個(gè)時(shí)間段S-T段的變化情況。

寧波新芝科器研究所JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，德國(guó)Heraeus低溫冷凍離心機(jī)，eppendorf PCR儀。TransGen Biotech提供 Trizol和 RT-PCR試劑盒。引物由上海生工設(shè)計(jì)，瓊脂糖凝膠電泳用德國(guó)產(chǎn)UVP(紫外透射儀)凝膠成像系統(tǒng)上掃描，電泳條帶用Photo shop7.0讀取均值。

1.4 標(biāo)本處理

取大鼠心臟左心室心尖部心肌組織10mm× 7mm×3mm大小，用生理鹽水反復(fù)沖洗后濾紙吸盡組織表面水分，電子天平秤取質(zhì)量，取100 mg心肌組織置于液氮罐中。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

兩步法測(cè)定心肌組織CRT含量，對(duì)CRTmRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。按照Trizol試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心檢測(cè)完成。

觀光農(nóng)業(yè)以農(nóng)業(yè)為基礎(chǔ)，以旅游為手段，以城市為市場(chǎng)，以參與為特點(diǎn)，以文化為內(nèi)涵，它的形式和類(lèi)型很多，其中規(guī)模較大的主要有5種：觀光農(nóng)園、農(nóng)業(yè)公園、教育農(nóng)園、森林公園和民俗觀光村。

經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后在凝膠成像系統(tǒng)成像，采用圖像識(shí)別分析系統(tǒng)(Photo shop7.0)掃描電泳條帶的光密度。按照以下公式進(jìn)行計(jì)算:RT-PCR產(chǎn)物比值=靶mRNA灰度值/內(nèi)對(duì)照(GAPDHmRNA灰度值) ×100%。上述過(guò)程需重復(fù)3次取其平均數(shù)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECG的變化

表1、2顯示，冠狀動(dòng)脈左前降支未結(jié)扎，各組STⅡ比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)扎后20 min、40 min，各組STⅡ值較結(jié)扎前均有不同程度的提高。缺血再灌注模型組抬高明顯，“內(nèi)關(guān)”組、“郄門(mén)”組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，“合谷”組的變化趨勢(shì)與模型組相近似，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。松扎后，抬高的ST段開(kāi)始回落，30 min和60 min后“內(nèi)關(guān)”組、“郄門(mén)”組STⅡ變化值與模型組、“合谷”組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 各組動(dòng)物缺血前STⅡ的比較(±s，mv)

表1 各組動(dòng)物缺血前STⅡ的比較(±s，mv)

組別 例數(shù) 結(jié)扎前FP假 手 術(shù) 組10 0.043±0.031缺 血 -再 灌 注 模 型 組 10 0.036±0.021針 刺 “ 內(nèi) 關(guān) ” 組 10 0.042±0.040 0.68 ＞0.05針 刺 “ 郄 門(mén) ” 組 10 0.037±0.017針 刺“合 谷 ”對(duì) 照 組10 0.036±0.025

表2 再灌注過(guò)程中STⅡ差值的變化(±s，min)

表2 再灌注過(guò)程中STⅡ差值的變化(±s，min)

注:與缺血-再灌注模型組比較:ΔΔP＜0.01;與針刺“合谷”對(duì)照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 例 數(shù) 結(jié)扎后20ˊ 結(jié)扎后40ˊ 松扎后30ˊ 松扎后60ˊ缺血-再灌注模型組 10 0.310±0.045 0.312±0.044 0.274±0.037 0.0260±0.037針 刺“ 內(nèi) 關(guān) ”組 10 0.241±0.026ΔΔ＊＊ 0.249±0.034ΔΔ＊＊ 0.177±0.040ΔΔ＊＊ 0.163±0.041ΔΔ*針 刺“ 郄 門(mén) ”組 10 0.226±0.040ΔΔ＊＊ 0.228±0.046ΔΔ＊＊ 0.159±0.039ΔΔ＊＊ 0.148±0.036ΔΔ*針刺“合谷”對(duì)照組 10 0.307±0.057 0.309±0.057 0.260±0.050 0.248±0.051 F 10.14 8.53 18.88 18.79 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 CRTmRNA表達(dá)率的變化

表 3圖 1顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織CRTmRNA的表達(dá)率很低，與模型組、“合谷”組比較差異顯著(P＜0.05);模型組與“內(nèi)關(guān)”治療組、“郄門(mén)”治療組比較，CRTmRNA表達(dá)率降低非常明顯(P＜0.01);模型組與“合谷”對(duì)照組比較，CRTmRNA表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);“內(nèi)關(guān)”組與“郄門(mén)”組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，鈣網(wǎng)蛋白(CRT)在缺血缺氧損傷中的作用非常重要，其過(guò)度的表達(dá)能夠抑制腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放，由此使得胞漿內(nèi)的鈣超載得以減輕［2］。在電誘導(dǎo)犬血栓模型上，冠脈灌流液中加入CRT可防止冠狀動(dòng)脈左旋支梗塞，顯示鈣網(wǎng)蛋白可能是通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞NO合成與釋放來(lái)預(yù)防血栓形成的。徐菲菲等［3］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理24 h后心肌細(xì)胞內(nèi)鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)增加，表明其參與了預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)。

與上述研究相反，有報(bào)道人類(lèi)胚胎腎細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CRT，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+增多，活化鈣調(diào)節(jié)磷酸酶，增加細(xì)胞凋亡的敏感性。還有學(xué)者報(bào)道大鼠H9c2成肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)鈣網(wǎng)蛋白，細(xì)胞數(shù)量減少，DNA雙鏈斷裂增加，易于發(fā)生凋亡;蛋白磷酸酶(PP2A)表達(dá)及活性上調(diào)，提示鈣網(wǎng)蛋白的過(guò)表達(dá)，改變Ca2+穩(wěn)態(tài)上調(diào)PP2A表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［4］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同是否與細(xì)胞類(lèi)型的不同或是應(yīng)激刺激的不同有關(guān)，需要進(jìn)行深入的研究。

表3 各組大鼠心肌組織CRTmRNA表達(dá)率比較(±s，%)

表3 各組大鼠心肌組織CRTmRNA表達(dá)率比較(±s，%)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與缺血-再灌注模型組比較:△△P＜0.01

組別 例數(shù) CRTmRN FP假 手 術(shù) 組8 0.560±0.095缺血-再灌注模型組 8 0.735±0.123*針 刺 “ 內(nèi) 關(guān) ”組 8 0.955±0.212＊＊△△15.10 ＜0.01針 刺 “ 郄 門(mén) ”組 8 1.058±0.144＊＊△△針刺“合谷”對(duì)照組 8 0.776±0.100*

圖1 內(nèi)參基因(307bp)、CRT基因(197bp)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖

RT-PCR方法是在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行基因分析直觀、特異的方法，它將特異性的免疫反應(yīng)、可見(jiàn)的組織化學(xué)變化與具有顯像、放大作用的顯微鏡相結(jié)合，簡(jiǎn)便、快速地對(duì)細(xì)胞因子的mRNA進(jìn)行定性或定量分析［5］。

從RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，“內(nèi)關(guān)”組、“郄門(mén)”組CRTmRNA表達(dá)率明顯上調(diào)，較模型組及“合谷”組均有顯著升高。此項(xiàng)指標(biāo)的觀察結(jié)果與血清CRT含量的變化及心肌組織CRT蛋白表達(dá)的變化相一致［5］，進(jìn)一步說(shuō)明經(jīng)穴對(duì)靶器官的特異性調(diào)節(jié)作用。

大量研究證明，在缺血－再灌注前后給予預(yù)處理，可阻斷細(xì)胞的壞死、凋亡過(guò)程，減輕缺血再灌注損傷［6］。本項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的高表達(dá)鈣網(wǎng)蛋白可對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用相吻合，反映了鈣網(wǎng)蛋白的高表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)作用，Ca2+超載的減輕可能是通過(guò)鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)的上調(diào)使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+結(jié)合能力增強(qiáng)，由此起到了保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。對(duì)于電針激發(fā)鈣網(wǎng)蛋白參與細(xì)胞保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制我們會(huì)進(jìn)一步研究。

［1］袁葉，田岳鳳，王軍，等．針刺手厥陰心包經(jīng)穴對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠鈣網(wǎng)蛋白的影響［J］．中醫(yī)雜志，2011，52(3): 227-230．

［2］XIA C M，CHEN J，WANG J，et al．Differential expressions of nNOS and iNOS in the rostral ventrolateral medulla induced by electroacupuncture in acute myocardial ischemia rats［J］．Acta Physiologica Sinica，2008，60(4):453-461．

［3］徐菲菲，劉秀華，祝筱梅．鈣網(wǎng)蛋白參與缺氧預(yù)處理對(duì)氧化應(yīng)激損傷大鼠成心肌H9C2細(xì)胞的保護(hù)作用［J］．中國(guó)病理生理雜志，2008，24(8):1457-1463．

［4］IHARA YS，URATA YS，GOTO SJ，et al．Role of calreticulin in the sensitivity of myocardiac H9c2 cells to oxidative stress caused by hydrogen peroxide．American Journal of Physiology［J］．Cell Physiology，2006，290(1):208-221．

［5］陳名紅，陳毅堅(jiān)，葉艷青，等．用半定量RT-PCR法分析基因表達(dá)水平的影響因素［J］．貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(8):28-30．

［6］徐菲菲，劉秀華，張振英，等．低氧后處理誘導(dǎo)鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)上調(diào)的心肌保護(hù)機(jī)制［J］．生理學(xué)報(bào)，2009，61(1):35-42．

Effects of Electroacupuncture at the Points of the Pericardium Meridian in rate of Calreticulin Gene Expression in Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury

TIAN Yue-feng1，YUAN Ye2，WANG Jun1，LI Lei-yong3
(1．Department of Acupuncture＆Massage，Shanxi College of TCM，Taiyuan 030024，China; 2．The Affiliated Hospital of Shanxi College of TCM，Taiyuan 030024，China; 3．The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective:To investigate the effects of electroacupuncture(EA)of the points at the Pericardium Meridian of Hand-Jueyin on the changes of gene expression rates of CRTmRNA in myocardial ischemia and reperfusion injury rats so as to explore the specific relation between Meridian and Zangfu．Methods:Fifty Wistar rats anesthetized by 10%urethane were evenly randomized into sham，model，EA-“Neiguan”(PC6)，EA-“Ximen”(PC5)，EA-“Hegu”(LI4)groups．Under artificial respiration，MI/R model was established by ligation of the left descending anterior branch(DAB)of the coronary artery for 40 min，followed by reperfusion for 60 min．EA was applied to the above mentioned acupoints for 20 min，two times altogether．Then，the myocardial sample(below the ligationsite of DAB)of the left cardiac ventricle was taken for observing the changes gene expression of CRTmRNA．Results:The expression of sham group is less．Model group compared with“Neiguan”group，“Ximen”group，CRTmRNA expression is reduced very significant;model group compared with the“Hegu”group，CRTmRNA expression was no significant difference;between“Neiguan”and“Ximen”group there was not significantly different．Conclusions:The points of the Pericardium Meridian can obviously improve the gene expression rate of CRTmRNA，reduce injury caused by the calcium overload of myocardial cell．

Acupuncture;Myocardial ischemia/reperfusion injury;Calreticulin;RT-PCR

R246．9

B

1006-3250(2017)01-0105-03

2016-07-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30873240)-針刺對(duì)缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞CaMKⅡ信號(hào)傳遞作用及Akt心肌保護(hù)作用的研究;山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2010011056-1)-針刺激活A(yù)kt信號(hào)通路對(duì)再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡干預(yù)機(jī)制的研究

田岳鳳(1963-)，女，山西五臺(tái)人，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事穴位特異性研究。