宋曙霞，李建軍，劉 穎，羅有文，黃利英

(1．廣東省婦幼保健院，廣州 510000;2．中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣州 510000)

冠心病血瘀證血管病變數(shù)與ACE基因多態(tài)性的相關(guān)性研究*

宋曙霞1，李建軍2△，劉 穎1，羅有文1，黃利英1

(1．廣東省婦幼保健院，廣州 510000;2．中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣州 510000)

目的:探討冠心病血瘀證血管病變數(shù)與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因多態(tài)性的相關(guān)性。方法:運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)對(duì)119例冠心病血瘀證患者進(jìn)行ACE基因檢測，觀察DD、DI、II基因型頻率及等位基因頻率。結(jié)果:冠心病血瘀證者ACE基因DD、I/D性患者血管狹窄支數(shù)較II型多。結(jié)論:冠心病血瘀證ACE基因DD、I/D型患者血瘀證嚴(yán)重。

冠心病;血瘀證;血管病變;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因(ACE基因);多態(tài)性

冠心病是最常見的心血管疾病，血瘀證是冠心病患者中最常見的中醫(yī)證型。目前發(fā)現(xiàn)一些基因多態(tài)性影響脂質(zhì)代謝、血栓形成、血管舒張、收縮等病理生理過程，與冠心病發(fā)生的危險(xiǎn)性增加密切相關(guān)，其中以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性研究較為深入［1］。國內(nèi)外探討ACE基因多態(tài)性與冠心病的研究比較深入，但探討冠心病血瘀證與該基因多態(tài)性研究相對(duì)較少。本研究以冠心病血瘀證患者為研究對(duì)象，探討冠心病血瘀證血管狹窄程度與ACE基因多態(tài)性的相關(guān)性，以期為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年6月至2011年3月119例廣東籍中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院門診及住院的119例冠心病血瘀證患者，對(duì)入選者進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影檢查，根據(jù)檢查結(jié)果分別對(duì)血管狹窄數(shù)為0、1、2、≥3的研究對(duì)象進(jìn)行分組，各組別年齡、體質(zhì)量、家族史等基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。抽取患者靜脈血3 ml抗凝，充分混勻后放入－20℃冰箱冷藏室保存待檢，對(duì)患者ACE基因型進(jìn)行檢查。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照1979年世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的缺血性心肌病“心絞痛”“心肌梗死”的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，以患者臨床癥狀、體征和病史結(jié)合心電圖改變或冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果進(jìn)行診斷。

1.2.2 中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)［3］分為心血瘀證和非心血瘀證。血瘀證標(biāo)準(zhǔn):舌質(zhì)紫暗或舌體瘀斑、瘀點(diǎn)、舌下靜脈曲張瘀血;固定性疼痛或絞痛，或者腹痛拒按;血不循經(jīng)而停滯及出血后引起的血瘀、黑糞、皮下瘀斑;月經(jīng)紊亂、經(jīng)期腹痛、色黑有瘀斑、少腹急結(jié)等。

1.2.3 冠狀動(dòng)脈造影診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)美國心臟協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，冠狀動(dòng)脈狹窄程度以狹窄部位與臨近正常管徑減少百分比計(jì)算。直徑狹窄＜50%為正常;50%～74%為輕度狹窄;75%～94%為中度狹窄;95%～99%為重度狹窄;100%為完全閉塞。有一處及以上狹窄程度50%為陽性。病變累計(jì)左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)和右冠狀動(dòng)脈(RCA)中的1支者為單支病變，2支者為2支病變，3支者為3支病變;左主干(LM)病變者，無論LAD或LCX有無病變者，均判定為2支病變。

1.3 主要試劑與儀器 Biometra T-Gradient PCR machine(PCR儀)，Biorad power FAQ200 elctrophoresis machine電泳儀，Shimadzu RNA/DNA純度檢測儀，BeckmanCoulterAllegraX -12R centrifuge(常溫低速離心機(jī))，Hettich Universal 32R Zentrifugen(臺(tái)試低溫高速離心機(jī))，Uvidoc Uvitec BTX-20M(紫外觀察暗箱)。試劑使用 Omega Company提供的 BLOOD DNA Kit提取DNA，按照DNA試劑盒提供的詳細(xì)步驟提取DNA。引物設(shè)計(jì)Forwardprimer:CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT，Reverse primer:GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT。

1.4 PCR檢測

1.4.1 PCR擴(kuò)增 在冰上按下列順序加入200ul的PCR管:5 μl模板DNA，1ul上游引物，1 μl下游引物，25 μl premer Taq(D331A)，再加入18 μl的雙蒸水補(bǔ)足總體積為50 μl。PCR儀上94℃5 min初期變性，再94℃變性30 s，62℃復(fù)性30 s，72℃延伸1min，32個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min結(jié)束。

1.4.2 PCR鑒定 2%瓊脂糖凝膠電泳，在每個(gè)孔中加入4 μlPCR反應(yīng)產(chǎn)物，1 μl膠體金，1 μl 6 ×Loading Buffer混勻液，電泳，紫外燈檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

ACE各基因型頻率和等位基因頻率經(jīng)過Hardy Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各組間頻率比較用χ2檢驗(yàn)，通過精確概率法分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電泳結(jié)果

圖1顯示，基因型判別:ACE基因上若存在I/D Alu序列，PCR產(chǎn)物490bp，即為插入型(I型);沒有Alu序列，PCR產(chǎn)物為190bp，為缺失型(D)型;PCR產(chǎn)物為490bp，190bp即為I/D型，因此ACE基因型可分為II、I/D、DD 3種基因型。

2.2 冠心病血瘀證人群ACE基因頻率分布

119例研究對(duì)象中，II型28例，ID型42例，DD型49例。3種基因型頻率分別為41.2%、35.3%、23.2%。I、D等位基因分布頻率為41.2%、51.8%，這些比例與Hardy Weinberg平衡一致，具有群體代表性。

2.3 冠心病血瘀證、非血瘀證患者血管狹窄數(shù)、支架數(shù)與ACE基因型分布

表1顯示，冠心病血瘀證患者血管狹窄數(shù)與ACE基因DD、I/D、II型分布比較，DD、I/D型基因患者血管狹窄支數(shù)較 II型多(χ2=12．96，P＜0.05)。

表2顯示，冠心病非血瘀證患者的血管狹窄數(shù)與ACE基因型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.494， P=0.960＞0.05)。

2.5

表3顯示，支架數(shù)與ACE基因型分布比較，冠心病血瘀證支架數(shù)與ACE基因DD、I/D、II型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.826，P＜0．05)，隨支架數(shù)的增多II基因型分布減少。

表1 冠心病血瘀證血管狹窄數(shù)與ACE基因型分布比較

表2 冠心病非血瘀證血管狹窄數(shù)與ACE基因型分布比較

表3 冠心病血瘀證心臟放支架數(shù)與ACE基因型分布比較

圖1 冠心病血瘀證患者ACE基因型分布

3 討論

人類ACE基因位于17號(hào)染色體長臂q23位點(diǎn)，長度是21 kb，包含26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子，其中第16內(nèi)含子存在287bp DNA序列的插(I)或缺失(D)片段，構(gòu)成ACE基因I/D多態(tài)性［4］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DD(缺失)表型者血清ACE水平比II者(插入)高出2倍，I/D表型者ACE水平介于DD表型及II表型中間。Diamantopoulos等［5］發(fā)現(xiàn)，DD基因型攜帶者動(dòng)脈粥樣硬化形成危險(xiǎn)因素高。Riera FortunyC［6］對(duì)歐洲南部冠心病患者研究表明，ACE基因型中DD、ID基因型與冠心病具相關(guān)性，攜帶D等位基因者，血清ACE基因集中較明顯，這將增加血管緊張素II對(duì)血管的不利影響，也被認(rèn)為是DD基因型增加了冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。

血瘀證是冠心病最常見證型，氣血陰陽失調(diào)是其基本病理變化?，F(xiàn)代研究多集中在血液流變學(xué)、凝血功能、血管內(nèi)皮功能損傷、炎性介質(zhì)等方面［7］。尹克春［8］通過研究發(fā)現(xiàn)，冠心病病人循環(huán)血的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)CD11b、CD18表達(dá)增加與冠心病血瘀證關(guān)系密切;冠心病患者的細(xì)胞免疫功能降低而體液免疫應(yīng)答增強(qiáng)，并表現(xiàn)為易感染和慢性炎癥過程，大量單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮一樣會(huì)增加血流力，可能是形成血瘀證的原因之一。PueeettiL［9］等研究認(rèn)為，F(xiàn)VII升高致血液處于高凝狀態(tài)、斑塊破裂、局部強(qiáng)烈的凝血反應(yīng)等因素都會(huì)引起血管堵塞。冠心病血瘀證與ACE基因多態(tài)性的相關(guān)性研究較少。毛以林等［10］研究結(jié)果顯示，冠心病血瘀證組ACE基因型DD型及D等位基因頻率比非血瘀證組和健康對(duì)照組高。張鵬［11］等研究顯示，多支病變以痰瘀相兼、瘀血證、痰濁證為主。

本實(shí)驗(yàn)采用PCR方法對(duì)119例冠心病血瘀證患者血管狹窄數(shù)與ACE基因I/D多態(tài)性的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，冠心病血瘀證患者ACE基因DD、I/D型，心臟多支血管可能存在病變。這也表明，冠心病血瘀證患者的嚴(yán)重程度與ACE基因DD型及I/D型呈正相關(guān)性，揭示了冠心病血瘀證血管病變支數(shù)與ACE基因多態(tài)性存在一定的關(guān)系。與王階［12］等研究認(rèn)為冠心病患者冠脈病變的支數(shù)、狹窄程度與血瘀證存在一定的關(guān)聯(lián)結(jié)果一致。該結(jié)論對(duì)于臨床有一定的指導(dǎo)意義，即ACE基因型的檢測可以作為冠脈造影檢測之前的一種篩查方式，如果檢測ACE基因多態(tài)性示，DD、ID型時(shí)患者可能存在多支病變，對(duì)于這類患者可以進(jìn)一步行冠狀動(dòng)脈造影檢查。在本研究基礎(chǔ)上，可繼續(xù)探討冠心病血瘀證積分與冠狀動(dòng)脈血管狹窄積分是否具有相關(guān)性等進(jìn)行深入研究，血瘀證并不等同于西醫(yī)學(xué)的某方面指標(biāo)，是多基因、多系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。因此，血瘀證與基因之間的相關(guān)性更需要廣大醫(yī)學(xué)工作者從基因組學(xué)、蛋白組學(xué)進(jìn)行更深入的探索研究。

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［3］中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)活血化瘀研究專業(yè)委員會(huì)．血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1987，7(3):129．

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［11］張鵬，劉鵬，徐偉建，等．368例冠心病冠脈病變特點(diǎn)與中醫(yī)證型的相關(guān)性研究［J］．中西醫(yī)結(jié)合心腦血管雜志，2010，8 (11):1308-1311．

［12］王階，何慶勇，馬長生，等．基于冠脈造影的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病冠脈病變與血瘀證的相關(guān)性研究［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，28(12):1074-1077．

The Association Research between Cardiovascular Disease Variables of the Blood Stasis Syndrome of Coronary Heart and ACE Gene Polymorphism

SONG Shu-xia1，LI Jian-jun2△，LIU Ying1，LUO You-wen1，HUANG Li-ying1
(1．Maternal and Child Care Service Center，Guangdong Province，Guangzhou 510000，China; 2．Sun Yi-xian Memorial Hospital of Zhongshan University，Guangzhou 510000，China)

objective:In order to discover The association between the blood stasis syndrome of coronary heart disease with cardiovascular disease variables and Angiotensin converting enzyme gene Polymorphism．Methods:To observe the distribution of ACE gene DD、DI、II and allele frequencies，we detect the angiotensin converting enzyme gene polymorphism of 119 cases in the group of syndrome of coronary heart disease with the method of PCR technology．Results:Cardiovascular disease variables of the cases with ACE gene DD DI are more than those with ACE gene II．Conclusion:The patients of Blood stasis syndrome of coronary heart disease carry ACE gene DD、DI are more seriously than those carry ACE II．

Coronary heart disease;Blood stasis syndrome;Vascular lesions;Angiotensin converting enzyme gene; Polymorphism

R541．4

B

1006-3250(2017)01-0090-03

2016-07-26

廣東省科技計(jì)劃課題(2008B030301074);廣東省中醫(yī)藥局課題(1060167)

宋曙霞(1979-)，女，湖南人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合臨床與研究。

△通訊作者:李建軍(1965-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合心血管疾病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究，Tel:13922389869。