李 波，姜 泉，鞏 勛，吳振宇，唐曉頗，楊 卉，焦 娟

(中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

【實驗研究】

清熱活血方藥對CIA大鼠Wnt信號通路成骨細胞相關因子的影響*

李 波，姜 泉△，鞏 勛，吳振宇，唐曉頗，楊 卉，焦 娟

(中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

目的:分析清熱活血方(QRHX)對類風濕關節(jié)炎大鼠Wnt信號通路相關因子表達的影響，探討清熱活血方藥對CIA大鼠骨破壞的保護機制。方法:SD大鼠40只按隨機數字表法分為正常組、模型組、清熱活血方藥組、依那西普組。通過滑膜病理切片觀察各組大鼠關節(jié)滑膜病理改變，采用RT-PCR方法對各組大鼠滑膜DKK-1、β-catenin基因mRNA表達水平進行對比分析，通過ELISA檢測各組大鼠血清DKK-1、β-catenin、TCF、LRP5的蛋白含量。結果:滑膜病理顯示清熱活血方藥組大鼠滑膜中的炎癥水平較模型組明顯減輕，清熱活血方藥組大鼠滑膜中DKK-1mRNA表達水平和血清中DKK-1含量較模型組明顯減少，β-catenin mRNA表達水平及血清β-catenin、TCF、LRP5含量與模型組比較顯著升高。結論:清熱活血方藥能降低滑膜炎癥水平，抑制Wnt信號通路中DKK-1細胞因子的表達，促進β-catenin、TCF、LRP5的表達，可能通過作用于Wnt/β-catenin通路在CIA大鼠骨破壞過程中發(fā)揮骨保護作用。

類風濕關節(jié)炎;Wnt信號通路;清熱活血方;骨保護作用

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以滑膜炎和骨質破壞為主要病理特征，可以導致全身多系統(tǒng)損害的自身免疫性疾?。?］，發(fā)病以圍絕經期女性多見，男女比例為1∶3。目前世界范圍內患病率為1%左右，我國的發(fā)病率約為0.3% ～0.5%［2］。RA的骨破壞進程呈高速型，可以引起骨局灶性、關節(jié)旁性和系統(tǒng)性破壞丟失，是世界上主要致殘性疾病之一［3］。預防和阻止骨破壞是治療RA的關鍵和目標所在。RA骨破壞是由炎癥局部破骨細胞分化增加和成骨細胞功能降低引起，在 RA發(fā)病過程中骨吸收和骨形成都有不同程度的紊亂，即破骨細胞因子增加對RANKL的表達，因此增加局部破骨細胞的產生。同時，過度表達的Dickkopf1(Dkk-1)抑制Wnt信號通路［4］，而Wnt信號通路是成骨細胞產生和發(fā)揮作用的主要通路，因此減少成骨細胞的合成。本實驗立足于成骨細胞研究其對Dkk/Wnt信號通路的作用，旨在從多靶點、多角度闡示清熱活血方藥治療RA骨破壞所發(fā)生護骨機制的分子生物學基礎。

1 材料

1.1 動物及分組

SD雌性大鼠40只，體質量(220±10)g，購于北京實驗動物研究中心(動物合格證編號BLARC (京)2015-0052)，按隨機數字表法分為正常組、模型組、清熱活血方藥組、依那西普(Etanercept)治療組。

1.2 試劑及儀器

完全弗氏佐劑5 ml(貨號7024，批號130189)，生產廠家(Chondrex，inc);DMSO(貨號D-5790)，購自Sigma公司;免疫源性牛II型膠原(貨號20313，批號130135)，生產廠家(Chondrex，inc);手提式均質儀(型號T10 Basic Ultra-turrax，品牌IKA)。

1.3 藥物

清熱活血方中藥制劑由中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院科研藥房提供，煎藥室制備成1 g/ml的藥液。注射用依那西普(貨號S1105，生產批號G97161)25 mg/瓶，購自美國Pfizer公司，根據人體用藥量換算，制備成0.5 mg/kg依那西普注射液。

2 方法

2.1 免疫原制備

無菌條件下，將10 mg牛II型膠原加入至5ml乙酸中完全混勻，隨后于冰凍條件下，將5 ml完全弗氏佐劑緩慢加至牛II型膠原中，用均質儀攪拌乳化10 min，制成濃度為1 mg/ml牛II型膠原乳劑。

2.2 CIA大鼠造模

大鼠適應性飼養(yǎng)1周，在大鼠右側尾根部皮下注射0.2 ml牛II型膠原乳劑，進行第1次免疫。1周后以同樣方式于大鼠左側尾根部進行第2次強化免疫。

2.3 給藥方法

初次免疫后第10天起給藥，連續(xù)給藥28 d。清熱活血方藥組給予中藥水煎劑(24 g生藥/kg)灌胃，每日1次。依那西普治療組大鼠皮下注射依那西普0.5 mg/kg，每周2次。正常對照組及模型組給予生理鹽水灌胃2 ml，每日1次，生理鹽水皮下注射0.5 mg/kg，每周2次。

2.4 血液采集

首次免疫后的第38天，以10%的水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈無菌取血，離心后血清置于－80℃冰箱保存待測。

2.5 滑膜病理切片

無菌下取大鼠膝關節(jié)滑膜組織，于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，用無菌水清洗24 h后放到5%硝酸溶液中進行脫鈣2周，每周換液2次。脫鈣完全后，重新置于多聚甲醛溶液中固定、石蠟包埋、染色。

2.6 滑膜組織DKK1、β-catenin mRNA檢測

表1顯示，無菌條件下取各組大鼠滑膜組織，用RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA，并通過反轉錄反應體系得到cDNA，進行實時定量聚合酶鏈反應(Quantitative real-time PCR)，PCR儀檢測各樣本CT值，比較各組DKK1、β-catenin基因表達差異。

2.7 細胞因子測定

采用ELISA法檢測各組大鼠血清中DKK-1、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、低密度脂蛋白受體相關蛋白5(LRP-5)、T細胞因子(TCF)蛋白含量，操作按試劑盒說明進行。

表1 DKK1、β-catenin基因定量PCR引物序列

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數據以均數±標準差(±s)，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠膝骨關節(jié)滑膜病理分析

圖1顯示，大鼠膝骨關節(jié)滑膜病理切片顯示，正常組大鼠膝骨關節(jié)囊和滑膜形狀整齊規(guī)則。與正常組比較，模型組大鼠關節(jié)滑膜明顯增多，滑膜組織內可見廣泛炎癥細胞浸潤，滑膜內微血管密布擴張，厚度增寬，形成血管翳;關節(jié)囊可見囊性炎癥增生，囊內韌帶神經損傷，滑膜和纖維組織增生。清熱活血方藥組和依那西普治療組大鼠的膝骨關節(jié)滑膜同樣可見炎癥細胞聚集，滑膜和纖維組織增多，關節(jié)囊囊性炎癥，但與模型組比較滑膜數量明顯減少，炎癥程度明顯降低。

圖1 各組大鼠關節(jié)滑膜組織HE染色病理切片觀察(×40)

3.2 關節(jié)滑膜DKK1、β-catenin mRNA表達分析

表2顯示，模型組大鼠關節(jié)滑膜DKK-1mRNA的表達水平較正常組顯著升高，β-catenin的mRNA表達水平較正常組顯著降低。清熱活血方藥組和依那西普治療組大鼠關節(jié)滑膜中DKK-1mRNA的表達水平較模型組顯著降低(P＜0.05);而 β-catenin mRNA表達水平較模型組明顯升高(P＜0.05)。依那西普治療組與清熱活血方藥組比較，DKK1、βcatenin mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠關節(jié)滑膜基因DKK1、β-catenin表達水平(±s)

表2 各組大鼠關節(jié)滑膜基因DKK1、β-catenin表達水平(±s)

注:與正常組比較:#P＜0.05;與模型組比較:*P＜0.05，△P＜0.05

組別 鼠數 DKK-1 β-catenin正 常 組10 1.39±0.23 2.96±0.23模 型 組 10 2.93±0.28# 1.12±0.30#依 那 西 普 組 10 1.72±0.17* 2.13±0.25*清熱活血方藥組 10 1.78±0.44△ 2.49±1.07△

3.3 血清細胞因子DKK1、β-catenin、TCF和 LRP5的表達差異

表3顯示，模型組大鼠血清中DKK-1的表達水平較正常組顯著升高，而β-catenin、TCF和LRP5表達水平較正常組顯著降低。清熱活血方藥組和依那西普治療組大鼠血清中DKK-1含量較模型組顯著減少(P＜0.05);β-catenin、TCF和LRP5含量較模型組顯著升高(P＜0.05)。依那西普治療組與清熱活血方藥組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠血清中DKK-1和β-catenin含量(±s)

表3 各組大鼠血清中DKK-1和β-catenin含量(±s)

注:與正常組比較:#P＜0.05;與模型組比較:*P＜0.05，△P＜0.05

組別 鼠數 DKK-1(pg/ml) β-catenin(pg/ml) TCF(pg/ml) LRP5(pg/ml) 10 1.39±0.26 3.15±0.81 1.11±0.96 1.97±0.48模 型 組 10 2.24±0.35# 1.07±0.22# 0.41±0.13# 0.59±0.18#依 那 西 普 組 10 1.16±0.23* 1.78±0.54* 0.79±0.18* 1.19±0.21*清 熱 活 血 方 藥 組 10 1.21±0.33△ 1.63±0.38△ 0.73±0.09△ 1.31±0.25正常組△

4 討論

Wnt/β-catenin信號通路是類風濕關節(jié)炎成骨細胞形成過程中發(fā)揮促進效應的重要信號通路［5-6］。β-catenin作為Wnt信號通路中的中樞性因子發(fā)揮核心作用［7］。當Wnt蛋白與低密度脂蛋白受體相關蛋白5和6(LPR5/6)及共受體Fizzled受體發(fā)生反應時，引起 β-catenin在細胞內的過度堆積，甚至轉入許多細胞核內，與T細胞因子(TCF)/淋巴增強結合因子(LEF)產生反應，誘導成骨相關基因的活化，加速成骨細胞的生成和反應［8-9］。而Dkk1作為Wnt通路的拮抗劑，可以與Wnt蛋白的共同受體LPR5/6發(fā)生競爭性結合，導致β-catenin生成減少，抑制成骨細胞生成和活化，阻礙骨的形成［10］。研究發(fā)現，TNF-a作為炎癥因子能夠導致DKK-1分泌增多［11］。本研究選擇可溶性TNF-a受體質量組抗體融合蛋白依那西普作為陽性對照，該藥物能與細胞表面TNF-a受體競爭性結合，減少TNF-a受體的生成作用，降低DKK-1的分泌水平，進而減輕類風濕關節(jié)炎的炎癥水平和骨損壞程度?；A實驗和臨床研究已經證實，依那西普具有延緩RA骨破壞、促進新骨形成的作用［12］。本研究檢測各組大鼠滑膜基因DKK1、β-catenin mRNA轉錄水平和血清細胞因子DKK1、β-catenin的蛋白表達水平，發(fā)現清熱活血方藥和依那西普可以有效下調CIA大鼠滑膜中基因DKK-1的表達水平和血清中DKK-1蛋白的含量，上調CIA大鼠滑膜中基因βcatenin的表達水平和血清中β-catenin、TCF、LRP5蛋白的含量。清熱活血方藥在抑制DKK-1分泌和促進β-catenin、TCF、LRP5表達上與依那西普作用相同，說明清熱活血方藥也可能是通過作用于Wnt/ β-catenin通路在CIA大鼠骨破壞過程中發(fā)揮骨保護作用。

當前，類風濕關節(jié)炎骨破壞的認識主要基于“破骨細胞”與“成骨細胞”的骨免疫學說。前期實驗已表明，清熱活血方藥可以作用于OPG/RANKL/ RANK信號通路，減少炎癥因子和破骨細胞的分化生成，發(fā)揮一定的骨保護效應［13-14］。本實驗通過研究清熱活血方藥對Wnt/β-catenin信號通路的影響，發(fā)現清熱活血方藥可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進成骨細胞的生成來減輕類風濕關節(jié)炎的骨質破壞，說明清熱活血方藥可能通過調節(jié)破骨細胞和成骨細胞的平衡發(fā)揮骨保護作用。近期研究［15］發(fā)現，破骨細胞與成骨細胞具有緊密的聯系，破骨細胞可以間接地抑制成骨細胞的活性，減少體內骨的形成。清熱活血方藥在抑制破骨細胞形成和促進成骨細胞形成上同時發(fā)揮作用，抑制破骨細胞的同時促進成骨細胞的形成，對RA骨破壞的抑制和骨的重塑發(fā)揮了重要作用。

［1］EWAM，PALEOLOG．The vasculature in rheumatoid arthritis: cause or consequence［J］．Int J Exp Pathol，2009，90:249-261．

［2］王吉波，呂振華．類風濕性關節(jié)炎［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:5．

［3］GOSSEC L，DOUGADOS M，GOUPILLE P，et al．Prognostic factors for remission in early rheumatoid arthritis:a multiparameter prospective study［J］．Ann Rheum Dis，2004，63:675-680．

［4］王露霏，白丁，韓向龍．Wnt信號通路拮抗劑Dkk1調節(jié)骨代謝的最新進展［J］．中國組織工程研究，2013，17(2):337-341．

［5］ARNETT FC，EDWORTHY SM，BLOCH DA，et al．The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis［J］．Arthritis Rheum，1988，31(3):315-324．

［6］馬瑩瑩，張育．Wnt信號通路與RA的骨質代謝［J］．中國免疫學雜志，2010，26(12):1143-1145．

［7］ISSACK PS，HELFET DL，LANE JM．Role of Wnt signaling in bone remodeling and repair［J］．HSS J，2008，4(1):66270．

［8］熊雪婷，許碧蓮．Wnt信號通路在類風濕性關節(jié)炎發(fā)病機制中的研究進展［J］．中國藥理學通報，2014，30(1):13-15．

［9］SANGHA O．Epidemiology ofrheumatic diseases［J］．Rheumatology，2000，39(Suppl2):3-12．［10］許連靜，秦明群．Wnt/Dkk在骨改建中對成骨細胞和破骨細胞的雙向調節(jié)作用［J］．江蘇醫(yī)藥，2010，36:1933-5．

［11］DIARRA D，STOLINA M，POLZER K，et al．Dickkopt-1 is a master regulator of joint remodeling［J］．Nature Ivied，2007，13: 156-63．

［12］劉旸．腫瘤壞死因子-a與類風濕性關節(jié)炎［J］．Labeled Immunoassays＆Clin Med，2003，10(3):174-176．

［13］孔祥英，吳文斌，蘇曉慧，等．風濕清對成纖維樣滑膜細胞OPG，RANKL，TNF-a及IL-17表達的影響［J］．中國實驗方劑學雜志，2012，22(11):287-290．

［14］姜泉，周新堯，唐曉頗，等．清熱活血方在類風濕關節(jié)炎相關動物實驗和體外研究中對白介素17的影響［J］．中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2013，19(8):907-909．

［15］DEFANG Li，JIN LIU，et al．Osteoclast-derived exosomal miR-214-3p inhibits osteoblastic bone formation［J］．Nature communications，2016:1-15．

Effect of Qingre Huoxue Recipe on the Wnt Signal Pathway Related Factors in CIA Rats

LI Bo，JIANG Quan△，GONG Xun，WU Zhen-yu，TANG Xiao-po，YANG Hui，JIAO Juan
(Guang’anmen Hospital，CACMS，Beijing 100053，China)

Objective:To study the effect of QingreHuoxue Recipe(QRHX)on the expression of Wnt signaling pathway related factors in collagen-induced arthritis(CIA)rats，thus exploring the bone protection mechanism．Methods: 40 SD rats were randomly divided into the normal group，the model group，the QRHX group and the etanercept group．The changes of synovium pathomorphology were observed using synovial pathological．The DKK-1 and beta-catenin gene expression level of mRNA in rats synovial were analyzed by using RT-PCR method，and the protein content of DKK-1，beta -catenin，TCF，LRP5 beta in serum were detected by ELISA．Results:Compared with the model group，the synovium inflammation level significantly decreased in the QRHX group，and the DKK-1 mRNA expression in synovial and DKK-1 levels in serum decreased in QRHX group．The beta-catenin gene expression level and serum beta-catenin TCF，LRP5 content increased．Conclusion:QRHX Recipe could reduce the inflammation level，and play the bone protection effects by inhibiting expression of DKK-1 cytokines in the Wnt signaling pathway，increasing the expression of β-catenin，TCF，LRP5，beta cell factors，and promoting the formation of osteoblast．

Rheumatoid arthritis;Wnt signal pathway;Qingre Huoxue Recipe;Bone protection funtion

R285．5

B

1006-3250(2017)01-0075-03

2016-07-19

國家自然科學基金資助項目(81273719)-從DKK/Wnt信號通路探討清熱活血方藥治療類風濕性關節(jié)炎的護骨機制

李 波(1991-)，男，安徽六安人，醫(yī)學碩士，師從姜泉教授，從事類風濕關節(jié)炎的臨床與基礎研究。

△通訊作者:姜 泉，E-mail:doctorjq@126．com。