田 瑋，馬尚寅，龔延萍*，白志慧，哈斯巴根，鋼蘇和

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

家兔缺血再灌注型急性腎功能不全模型在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

田 瑋1，馬尚寅2，龔延萍1*，白志慧3，哈斯巴根3，鋼蘇和3

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

目的 評價(jià)以缺血再灌注方法復(fù)制的家兔急性腎功能不全模型的教學(xué)實(shí)用性、實(shí)驗(yàn)效果及穩(wěn)定性等，探索適合學(xué)生實(shí)驗(yàn)的安全、快速、有效的急性腎功能不全動(dòng)物模型建立方法。方法 對20只家兔采取切除右腎并夾閉左腎動(dòng)脈45 min后再灌注15 min的方法建立急性腎功能不全模型，對比缺血再灌注前后腎臟形態(tài)、血肌酐（Cre）及尿素氮（BUN）、尿蛋白等指標(biāo)。結(jié)果 缺血再灌注腎臟含血量顯著下降，腎臟大體形態(tài)與缺血再灌注前有肉眼可見的顯著區(qū)別。缺血再灌注后血樣BUN、Cre值較前均有所提高（P＜0.05）。結(jié)論 缺血再灌注家兔急性腎功能不全模型建立方法安全無毒，可在有限的實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)間內(nèi)完成，且操作難度適宜，便于實(shí)驗(yàn)前后對照，實(shí)驗(yàn)效果良好，可用于機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)等教學(xué)。

急性腎功能不全；缺血再灌注；動(dòng)物模型；家兔；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

急性腎功能衰竭是急性腎功能不全的晚期階段，在臨床上兩者往往屬于同一概念而不加區(qū)別[1]。該病病情發(fā)展急，病死率高，是臨床常見的危重病之一，一直受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，常應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。

根據(jù)急性腎功能不全病因的不同，復(fù)制動(dòng)物模型的方法也不同，如去甲腎上腺素滴注法、低灌注法、順鉑誘導(dǎo)、油酸法、結(jié)扎雙側(cè)輸尿管，等等[2]。對一般醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)而言，上述任意一種方法均能滿足教學(xué)需要，此時(shí)模型復(fù)制方法的便捷性、穩(wěn)定性、安全性以及實(shí)驗(yàn)效果的顯著性等則成為選擇造模方法時(shí)優(yōu)先考慮的因素。

現(xiàn)階段我國對缺血性腎功能衰竭模型的研究主要基于大鼠[3～5]和小鼠[6]，但大鼠、小鼠體型較小，對學(xué)生實(shí)驗(yàn)而言操作難度較大；腎的體積也小，不利于進(jìn)行細(xì)致觀察。相對而言，家兔體型較大，手術(shù)操作更為簡單，腎的體積也更利于觀察比較。但目前基于家兔的實(shí)驗(yàn)研究相對較少，針對醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的急性腎功能不全動(dòng)物模型復(fù)制研究的文獻(xiàn)僅有幾篇。本文以自身對照方式，對家兔腎缺血再灌注前后腎形態(tài)、血肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）、尿蛋白等指標(biāo)的變化情況進(jìn)行比較，評價(jià)缺血再灌注方法復(fù)制家兔急性腎功能不全模型的教學(xué)實(shí)用性、實(shí)驗(yàn)效果及穩(wěn)定性等。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

（1）取健康家兔20只，體重2～3 kg，雌雄不限。

（2）麻醉：耳緣靜脈注射20%氨基甲酸乙酯5 ml/kg進(jìn)行麻醉，麻醉后仰臥位固定。

（3）手術(shù)：頸部正中縱形切口，分離一側(cè)頸總動(dòng)脈；于恥骨聯(lián)合向上做正中縱切口，暴露膀胱。

（4）術(shù)前取樣：頸總動(dòng)脈取血，分別做BUN、Cre測定，并從膀胱內(nèi)抽取尿液做尿蛋白定性試驗(yàn)。

（5）缺血再灌注造模：①自胸骨劍突向下沿腹白線做正中縱切口（7～10 cm）[7]，鈍性分離肌肉，將腹腔內(nèi)容物推向左側(cè)，于右側(cè)后腹壁找到右腎及右腎蒂等組織，結(jié)扎并剪斷右腎蒂，摘除右腎[8]（右側(cè)腎蒂短，腎動(dòng)脈不易分離，摘除后左側(cè)腎能夠完全代償，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]）。將腹腔內(nèi)容物推向右側(cè)，在左側(cè)后腹壁找左腎及左腎蒂，分離左腎動(dòng)脈約1 cm。②阻斷血流：用動(dòng)脈夾阻斷左腎血液供應(yīng)（夾閉左側(cè)腎動(dòng)脈前，先將左腎動(dòng)脈夾閉數(shù)秒后恢復(fù)血供，反復(fù)數(shù)次，使其缺血預(yù)適應(yīng)，避免急性缺血損傷難以恢復(fù)[10，11]）。③恢復(fù)血流：阻斷血流45 min[3]后，松開左腎動(dòng)脈夾，恢復(fù)腎血流[12]，此時(shí)腎臟顏色由蒼白逐漸轉(zhuǎn)紅，表明再灌注成功，觀察無出血后關(guān)閉腹腔。

（6）利尿：由耳緣靜脈緩慢注射37℃0.9%生理鹽水50 ml，幫助利尿。

（7）灌注后取樣：缺血再灌注15 min后，再次從頸總動(dòng)脈取血分別做BUN、Cre測定，并從膀胱內(nèi)抽取尿液做尿蛋白定性試驗(yàn)。

（8）處死尸檢：處死家兔取腎，觀察腎臟外觀（體積、顏色、包膜緊張度等）及縱切面形態(tài)學(xué)（皮、髓質(zhì)分界和色澤等）改變。

1.2 觀察指標(biāo)

腎臟外觀及縱切面形態(tài)，血尿素氮，血肌酐，尿蛋白等指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

對正常腎和缺血再灌注后的實(shí)驗(yàn)?zāi)I進(jìn)行比較，可以明顯看出正常腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)界限明顯，整體顏色偏紅，含血量較高；而缺血再灌注后的腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)界限不清，大部分切面為淺粉色至白色，含血量較低。

2.2 血生化指標(biāo)（見表1）

表1 家兔腎缺血前與缺血再灌注后血BUN、Cre比較（±s）

表1 家兔腎缺血前與缺血再灌注后血BUN、Cre比較（±s）

t值P值BUN（mg/dL）Cre（μmol/L）缺血前4.45±0.60 73.07±9.41缺血再灌注后4.70±0.79 187.63±19.55 2.118 24.897 0.048 0.000

3 討論

急性腎功能不全的原因以急性腎小管壞死最為多見，而急性腎小管壞死的主要原因是腎缺血、再灌注損傷和急性腎中毒。當(dāng)發(fā)生持續(xù)腎缺血以及再灌注時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞因持續(xù)缺血或再灌注損傷而壞死；當(dāng)化學(xué)、生物、藥物性毒素或大量血紅蛋白、肌紅蛋白從腎排泄時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞可因中毒而變性壞死[1]。因此，腎功能不全動(dòng)物模型的復(fù)制方法主要有缺血性和中毒性兩大類[11～13]，目前較常用的方法有5種[14]，即夾閉腎動(dòng)脈，滴注去甲腎上腺素，注射汞劑（Hgcl2）、硝酸鈾或甘油，前兩種方法的目的是使腎發(fā)生嚴(yán)重缺血，第三、四種方法誘導(dǎo)發(fā)生急性腎中毒，最后一種方法兼有缺血性和內(nèi)源性毒物中毒兩類的特點(diǎn)[15]。其中，皮下或肌肉注射汞劑由于操作簡單、創(chuàng)傷小、病變穩(wěn)定，且重金屬汞是腎小管上皮細(xì)胞的特異性毒物，而被作為經(jīng)典方法常在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中使用。但此種模型建立方式存在接觸者中毒風(fēng)險(xiǎn)、“三廢”排放問題、造模時(shí)間長、學(xué)生造模成功率低、動(dòng)物浪費(fèi)嚴(yán)重、不便于自身對照等弊端。因此，急需改進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中腎功能不全動(dòng)物模型建立方式，找到適合學(xué)生實(shí)驗(yàn)的安全、快速、有效的方法。

本實(shí)驗(yàn)中夾閉腎動(dòng)脈后，腎組織血流阻斷，腎微循環(huán)發(fā)生嚴(yán)重障礙，造成腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞缺血、缺氧，三磷酸腺苷（ATP）生成減少，從而發(fā)生能量代謝障礙，影響腎小管主動(dòng)性離子交換功能，吸收和排泄功能均受到影響。如果ATP進(jìn)一步降低，則導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，使細(xì)胞發(fā)生下列不可逆的損傷：（1）腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、足細(xì)胞發(fā)生腫脹、退變；（2）腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞腫脹壞死；（3）腎小管壞死及壞死后脫落的細(xì)胞碎片可使管腔阻塞導(dǎo)致原尿回漏，引起間質(zhì)水腫；（4）毛細(xì)血管壁遭到破壞，通透性增加，水分透過管壁進(jìn)入組織，加重間質(zhì)水腫。在以上因素的共同作用下，腎組織血流量減少，腎小球?yàn)V過率降低。濾過膜本身的破壞及腎小球壞死又減少了濾過面積，加重了腎小球?yàn)V過功能障礙，最終引起腎臟排泄功能衰竭[16]。

缺血再灌注家兔急性腎功能不全模型采用切除右腎并夾閉左腎動(dòng)脈的方法，無需借助藥品，避免了使用劇毒化學(xué)藥品HgCl2的問題，既解決了中毒動(dòng)物處理及環(huán)境污染問題，又規(guī)避了毒麻藥品管理風(fēng)險(xiǎn)。另外，由于學(xué)生在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)課上手術(shù)技能訓(xùn)練較多，因此模型建立操作難度適宜，且判斷操作成功與否較肌肉注射更為容易，故該方法的造模成功率相對更高。此外，缺血再灌注的復(fù)制過程可在有限的教學(xué)時(shí)間內(nèi)完成，較HgCl2中毒（至少提前24 h注射）等造模方法周期短，在一次實(shí)驗(yàn)中完成從正常到疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸過程的觀察，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)流程，使實(shí)驗(yàn)節(jié)奏性更強(qiáng)；且可設(shè)立自身對照，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前后相關(guān)指標(biāo)比較，較空白對照結(jié)果更穩(wěn)定、更具說服力。同時(shí)，由學(xué)生自主完成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?，可進(jìn)一步加深印象，提高教學(xué)效果。

但是，我們觀察發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)中缺血再灌注的家兔血尿素氮變化并不明顯，再灌注后升高程度不及HgCl2中毒性模型的血液生化指標(biāo)變化明顯，這可能由于教學(xué)實(shí)驗(yàn)中BUN變化尚處于升高初期（BUN于再灌注16 h達(dá)到高峰[13]），也可能由于本實(shí)驗(yàn)中家兔品系不純、影響因素多等。另外，由于缺血再灌注模型需以外科手術(shù)方法造模，病理改變有局限性[14]，動(dòng)物的耐受性及學(xué)生手術(shù)操作熟練程度和水平，都是值得商討的問題?？紤]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、條件及方法等因素，尚需進(jìn)一步探討。從實(shí)驗(yàn)原始結(jié)果來看，由于實(shí)驗(yàn)處理后動(dòng)物腎功能受損，尿量明顯下降甚至無尿，往往不能測定尿蛋白和酚紅排泄率，因此以往實(shí)驗(yàn)中用到的這兩種檢測指標(biāo)，并不適用于急性腎功能不全模型。

綜上所述，兩種模型復(fù)制方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康募右赃x擇。缺血再灌注家兔急性腎功能不全模型建立方法安全無毒，可在有限的教學(xué)時(shí)間內(nèi)完成，且操作難度適宜，便于實(shí)驗(yàn)前后對照，實(shí)驗(yàn)效果良好，可用于對模型特異性要求不高的機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)等醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

[1]王建枝，殷蓮華.病理生理學(xué)[M].8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013.

[2]朱虹，楊進(jìn).急性腎功能衰竭動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀和評價(jià)[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，2005（2）：44-47.

[3]余曉東，廖波，鄧顯忠，等.一種新型實(shí)用的大鼠腎缺血再灌注損傷模型的建立[J].重慶醫(yī)學(xué)，2011（13）：1283-1284.

[4]易小敏，張更，馬帥軍，等.大鼠急性腎缺血再灌注損傷模型的建立與評估[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，11（21）：4027-4029，4042.

[5]陳光磊，王漢民，劉廣厚，等.大鼠急性腎臟缺血再灌注后處理動(dòng)物模型的建立[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（9）：812-814.

[6]吳建國，張丹，吳新勝，等.小鼠急性缺血-再灌注腎損傷模型的建立及體會(huì)[J].醫(yī)學(xué)信息（手術(shù)學(xué)分冊），2007（12）：1103-1105.

[7]Shah K G，Rajan D，Jacob A，et al.Attenuation of renal ischemia and reperfusion injury by human adrenomedullin and its binding protein[J].J Surg Res，2010，163（1）：110-117.

[8]李文歌，陳香美，廖洪軍，等.小鼠急性腎功能衰竭模型的建立[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1996（3）：188-189.

[9]崔艷秋，夏曉芳，趙海燕，等.家兔急性缺血性腎功能衰竭實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)及應(yīng)用[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2006，24（17）：78.

[10]Spandou E，Tsouchnikas I，Karkavelas G，et al.Erythropoietin attenuates renal injury in experimental acute renal failure ischaemic/reperfusion model[J].Nephrol Dial Transplant，2006，21（2）：330-336.

[11]Basile D P，Donohoe D，Cao X，et al.Resistance to ischemic acute renal failure in the Brown Norway rat：a new model to study cytoprotection[J]. Kidney International，2004，65（6）：2201-2211.

[12]Takada M，Nadeau K C，Shaw G D，et al.The cytokine-adhesion molecule cascade in ischemia/reperfusion injury of the rat kidney.Inhibition by a soluble P-selectin ligand[J].J Clin Invest，1997，99（11）：2682-2690.

[13]廖洪軍，陳香美.急性腎功能衰竭動(dòng)物模型的制備[J].腎臟病與透析腎移植雜志，1994（2）：155-157.

[14]趙自剛，牛春雨，侯亞利，等.兩種家兔急性腎功能衰竭模型復(fù)制的方法學(xué)比較[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)，2004（5）：21-23.

[15]劉翔，張白玉，王榮.四種急性腎衰竭模型的制作與體會(huì)[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2009（4）：16-19.

[16]馬麗杰，龔延萍.醫(yī)學(xué)機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2016.

（*通訊作者：龔延萍）

G424.4

B

1671-1246（2017）03-0096-03

注：本文系內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放基金指南型項(xiàng)目（kfsyszn201416）