劉東升，黃天臣

（1.河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河南 安陽 455000；2.安陽市腫瘤醫(yī)院，河南 安陽 455000）

CYP2W1在胃癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能研究

劉東升1，黃天臣2

（1.河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河南 安陽 455000；2.安陽市腫瘤醫(yī)院，河南 安陽 455000）

目的 探討CYP2W1在胃癌組織中的表達(dá)情況，研究其生物學(xué)功能。方法 采用免疫組化法檢測326例胃腺癌組織及326例正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白的表達(dá)情況；采用Western blotting實(shí)驗(yàn)隨機(jī)檢測10例胃腺癌組織和10例正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白的表達(dá)情況；建立4組胃癌組織、1組正常胃黏膜組織細(xì)胞系，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞系中CYP2W1 mRNA的表達(dá)量；通過平板克隆、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)研究其對胃癌細(xì)胞增殖和遷徙侵襲能力的影響。結(jié)果胃癌組織中，CYP2W1蛋白表達(dá)明顯高于正常胃黏膜組織（P＜0.05）。胃癌細(xì)胞中CYP2W1 mRNA的表達(dá)量明顯高于正常胃黏膜細(xì)胞（P＜0.05）。CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞的克隆形成數(shù)量明顯高于正常胃黏膜細(xì)胞（P＜0.05）。24 h/48 h CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞劃痕修復(fù)速率明顯高于正常胃黏膜細(xì)胞，CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞劃痕愈合面積明顯大于正常胃黏膜細(xì)胞，二者比較差異有顯著性（P＜0.05）。結(jié)論 CYP2W1僅在胃癌組織中表達(dá)，在正常胃黏膜組織中不表達(dá)；CYP2W1與胃癌細(xì)胞的生長增殖及遷徙侵襲能力明顯相關(guān)。

胃癌；CYP2W1；增殖；侵襲

胃癌（gastric cancer，GC）為消化道腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤。關(guān)于胃癌發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的基因及分子標(biāo)記物的研究對胃癌的早期診斷、治療、預(yù)后評估具有重要的臨床意義。CYP2W1為細(xì)胞色素P450超家族的新成員之一，具有腫瘤特異性。關(guān)于胃癌中CYP2W1的表達(dá)及其與胃癌增殖及侵襲能力關(guān)系的研究，迄今尚未見國內(nèi)外報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本來源

收集2010年3月至2015年3月于安陽市腫瘤醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)治療的326例胃癌患者的手術(shù)標(biāo)本，以多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，分別用于HE染色及免疫組織化學(xué)染色。新鮮標(biāo)本保存于液氮中，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。正常胃黏膜組織：取自距癌組織邊緣5 cm以上的手術(shù)標(biāo)本，經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為正常胃黏膜組織。人胃癌細(xì)胞系（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）由上海社會(huì)科學(xué)院細(xì)胞庫提供，常規(guī)傳代培養(yǎng)。正常胃黏膜上皮細(xì)胞系（GES-1）購于上海復(fù)祥生物公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用雙評分半定量積分法，對CYP2W1的免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析。以出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細(xì)胞作為陽性細(xì)胞，CYP2W1的陽性部位在細(xì)胞質(zhì)，高倍（400倍）鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野（每個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)）。陽性細(xì)胞＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；陽性強(qiáng)度評分：細(xì)胞無染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。將陽性細(xì)胞數(shù)得分和陽性強(qiáng)度得分相乘，0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），≥9分為（+++），將（++）和（+++）樣本判定為陽性表達(dá)，（-）和（+）樣本判定為陰性表達(dá)。

1.2.2 Western blot實(shí)驗(yàn) 使用細(xì)胞組織快速裂解液裂解組織，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白質(zhì)含量，-70℃保存。制備SDS-PAGE，蛋白電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，將硝酸纖維素膜放入封閉液中，置于37℃恒溫?fù)u床上，低速搖動(dòng)封閉2 h。將一抗按1∶1 000稀釋（參考抗體說明書），4℃搖床低速搖動(dòng)過夜孵育。洗脫緩沖液洗滌3次，時(shí)間分別為15 min、10 min、5 min。洗滌后進(jìn)行二抗孵育，二抗為羊抗兔，按1∶4 000稀釋，置于37℃恒溫?fù)u床上，低速搖動(dòng)孵育45 min。洗脫緩沖液洗滌3次，每次5 min。ECL顯色，暗房中曝光，顯影定影后膠片保存攝片，掃描后用Bandscan 5.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì)：CYP2W1上游引物AAGACGGTGGTGCTGACGG，下游引物GCTGGATGAGCTGGAAGATGG，長度106 bp；GAPDH上游引物TCAAGAAGGTGGTGAAGCA，下游引物AAAGGTGGAGGAGTGGGT，長度113 bp。引物由上海生工生物公司合成。提取胃癌細(xì)胞系（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）和正常胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）中總RNA，紫外分光光度計(jì)測量總RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qPCR擴(kuò)增。qPCR反應(yīng)條件為：94℃、5 min（預(yù)變性）一個(gè)循環(huán)；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃、10 min，4℃、2 min。對擴(kuò)增曲線所獲得的Ct值進(jìn)行分析，利用以前報(bào)道的2-△△Ct計(jì)算方法，算出CYP2W1mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 選取對數(shù)生長期（BGC-823、GES-1）細(xì)胞，常規(guī)處理，重懸成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1× 103/ml，接種，連續(xù)培養(yǎng)。出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止細(xì)胞培養(yǎng)，PBS液漂洗，固定，加入姬姆薩染液，沖洗，干燥。計(jì)數(shù)肉眼可見克隆形成的數(shù)量，或在低倍鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/200）×100%。

1.2.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 24孔板背后劃線，將BGC-823、GES-1以0.25%胰酶消化，制備培養(yǎng)單層細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞鋪滿全空時(shí)，劃痕，記錄鏡下劃痕區(qū)相對距離。繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h、24 h、48 h用PBS洗掉劃落的細(xì)胞，于倒置顯微鏡下拍照。倒置顯微鏡下測量細(xì)胞向致傷區(qū)遷移的相對距離，計(jì)算細(xì)胞實(shí)際遷移距離。采用Image J軟件檢測劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（1-各時(shí)間點(diǎn)劃痕面積/開始的劃痕面積）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組化結(jié)果相關(guān)分析采用χ2檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA），以α=0.05為顯著性水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CYP2W1蛋白在胃癌組織與正常胃黏膜組織中的表達(dá)

CYP2W1蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞質(zhì)，胞膜也有不同程度表達(dá)，呈淺黃至棕黃色。胃癌組織的CYP2W1陽性表達(dá)率為26.69%，顯著高于正常胃黏膜組織（0.00%）。胃癌組織與正常胃黏膜組織CYP2W1的陽性表達(dá)率有顯著性差異（χ2=100.396，P=0.000），見表1。

表1 胃癌與正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白表達(dá)比較

2.2 Western blot實(shí)驗(yàn)胃癌組織及正常胃黏膜組織CYP2W1蛋白的表達(dá)

應(yīng)用Western blotting實(shí)驗(yàn)對隨機(jī)選取的10例胃癌組織及10例正常胃黏膜組織中的CYP2W1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，胃癌組織中CYP2W1蛋白表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜組織（見表2），差異有顯著性（P＜0.05）。

表2 胃癌與正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白表達(dá)情況

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同胃癌細(xì)胞中CYP2W1 mRNA水平

4株胃癌（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）細(xì)胞中CYP2W1 mRNA表達(dá)水平明顯升高，而正常胃黏膜細(xì)胞（GES-1）中CYP2W1 mRNA基本無表達(dá)，二者比較差異有顯著性（P＜0.05）。此外，BGC-823細(xì)胞中CYP2W1 mRNA表達(dá)水平顯著高于SGC-7901、MKN-28、MGC-803細(xì)胞（P＜0.05），而后3種細(xì)胞CYP2W1 mRNA表達(dá)水平無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 BGC-823及GES-1細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正常胃黏膜細(xì)胞（GES-1）克隆形成的數(shù)量（25.18±4.36）明顯少于CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞（BGC-823）克隆形成的數(shù)量（57.92±8.17），差異有顯著性（P＜0.05）。正常胃黏膜細(xì)胞（GES-1）克隆形成率（12.59%）明顯低于CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞（BGC-823）克隆形成率（29.96%），差異有顯著性（P＜0.05），表明CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞的遷徙侵襲能力

應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞的遷徏侵襲能力，按劃痕實(shí)驗(yàn)要求逐步操作，拍照記錄0 h、24 h、48 h細(xì)胞的遷移變化，檢測劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。結(jié)果顯示：24 h/48 hCYP2W1陽性胃癌細(xì)胞（BGC-823）劃痕修復(fù)率明顯高于正常胃黏膜細(xì)胞（GES-1），CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞（BGC-823）劃痕愈合面積明顯大于正常胃黏膜細(xì)胞（GES-1），二者比較差異有顯著性（P＜0.05），表明CYP2W1陽性胃癌細(xì)胞的遷徙侵襲能力明顯增強(qiáng)。

3 討論

臨床研究表明，CYP2W1作為一種特異性的腫瘤因子在近30%的結(jié)腸癌中表達(dá)，而在正常健康組織中不表達(dá)或無意義[1，2]。Stenstedt K等[3]應(yīng)用免疫組化法檢測CYP2W1在235例II期和III期結(jié)腸癌中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：CYP2W1在30%的腫瘤中高水平表達(dá)，CYP2W1陽性表達(dá)水平與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，CYP2W1在結(jié)直腸癌原發(fā)性腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移進(jìn)展過程中的表達(dá)呈升高趨勢，1/3的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、近一半的肝轉(zhuǎn)移患者CYP2W1高表達(dá)。

本研究結(jié)果：326例胃癌組織中，87例CYP2W1表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為26.69%。顯著高于正常胃黏膜組織（0.00%），胃癌組織與正常胃黏膜組織CYP2W1陽性表達(dá)率有顯著性差異（χ2=100.396，P=0.000）。應(yīng)用Western blotting實(shí)驗(yàn)隨機(jī)檢測10例胃腺癌組織和10例正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論。采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測BGC-823細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示：BGC-823克隆形成數(shù)量明顯高于GES-1，差異有顯著性（P＜0.05）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示：24 h/48 hBGC-823劃痕愈合率明顯高于GES-1，BGC-823劃痕愈合面積明顯大于GES-1，差異有顯著性（P＜0.05）。

研究表明[4]，在結(jié)直腸癌細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)CYP2W1的細(xì)胞系（SW480）顯示兩種化合物：ICT2705和ICT2706，轉(zhuǎn)換后將CYP2W1共價(jià)結(jié)合到DNA，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而化合物本身對腫瘤細(xì)胞無傷害作用。異種移植研究發(fā)現(xiàn)，在SCID小鼠體內(nèi)移植表達(dá)CYP2W1的結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞，然后應(yīng)用ICT2706治療，已顯示出完全抑制腫瘤細(xì)胞生長但對動(dòng)物本身無明顯傷害的可喜結(jié)果。該研究證明，ICT2705和ICT2706這兩種混合物，能夠被CYP2W1激活而成為有效的抗腫瘤劑。CYP2W1作為腫瘤靶向治療的一種新的藥物治療靶標(biāo)，可能成為腫瘤治療的又一方法。

[1]Karlgren M，Gomez A，Stark K，et al.Tumor-specific expression of the novel cytochrome P450 enzyme，CYP2W1[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，341（2）：451-458.

[2]Gomez A，Karlgren M，Edler D，et al.Expression of CYP2W1 in colon tumors：regulation bygene methylation[J].Pharmacogenomics，2007（8）：1315-1325.

[3]Stenstedt K，Hallstrom M，Johansson I，et al.The expression of CYP2W1：a prognostic marker incolon cancer[J].Anticancer Res，2012（32）：3869-3874.

[4]Travica S，Pors K，Loadman P M，et al.Colon cancer-specific cytochrome P4502W1 converts duocarmycin analogues into potent tumor cytotoxins[J]. Clin Cancer Res，2013（19）：2952-2961.

R735.2

B

1671-1246（2017）03-0151-02