吳寧鵬，彭麗，孟蕾，陳彥龍，馬浩軒(．河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008； ．鄭州大學(xué)，鄭州 450000； ．河南省鄭州市第七高級中學(xué)，鄭州 450008)

高效液相色譜-熒光法測定牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物的殘留量

吳寧鵬1，彭麗1，孟蕾1，陳彥龍2，馬浩軒3
(1．河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008； 2．鄭州大學(xué)，鄭州 450000； 3．河南省鄭州市第七高級中學(xué)，鄭州 450008)

建立了同時測定牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物的高效液相色譜-熒光檢測方法。試樣中待測物經(jīng)乙酸乙酯提取，酸性氧化鋁固相萃取柱和MCX固相萃取柱凈化，高效液相色譜-熒光法測定，以外標(biāo)法定量。藥物在5～2000 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。方法的檢出限為0.025 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg，在不同組織中添加濃度范圍為0.05～10 mg/kg，其平均回收率為60.6%～119.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～19.1%之間。方法抗干擾能力強、靈敏度高，適用于牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物殘留量的測定。

牛羊組織；阿苯達(dá)唑及其代謝物；高效液相色譜-熒光法

阿苯達(dá)唑(ABZ)是一種苯并咪唑類驅(qū)蟲藥物，是抗蟲性最強的驅(qū)蟲藥物之一。廣泛用于動物的腸道寄生蟲感染病，在我國獸醫(yī)臨床使用最廣泛[1]。阿苯達(dá)唑在動物體內(nèi)不穩(wěn)定，動物口服攝入后，經(jīng)腸道消化后會在較短時間內(nèi)代謝為阿苯達(dá)唑亞砜(ABZSO)、阿苯達(dá)唑砜(ABZSO2)、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜(ABZ-2NH2-SO2)[2]。動物毒理學(xué)表明阿苯達(dá)唑及其活性代謝物阿苯達(dá)唑亞砜具有致畸及胚胎毒性作用[3]。

由于一些養(yǎng)殖戶為追求經(jīng)濟利益，違規(guī)使用而且長期、超量使用，從而使阿苯達(dá)唑及其代謝藥物在動物組織中殘留，因此，世界食品法典委員會和世界各國對動物源性食品中阿苯達(dá)唑藥物殘留均有嚴(yán)格的限量要求，國際貿(mào)易中也對其限量有嚴(yán)格規(guī)定[4]。我國規(guī)定在牛、豬、羊、雞等動物的肌肉、脂肪、肝、腎等食品中阿苯達(dá)唑及其代謝藥物最高殘留限為0.05～1.0 mg/kg[5]。國內(nèi)外對阿苯達(dá)唑及其代謝物檢測分析方法報道較多，主要包括免疫檢測法(ELISA)[6]、高效液相色譜法(HPLC)[2,7-10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[11-12]和氣相質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS/MS)[13]等。其中，HPLC-FLD法因具有檢測成本低、靈敏度高等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢測。目前牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝藥物殘留的檢測方法中，存在空白干擾嚴(yán)重、靈敏度低、適應(yīng)性差等問題，因此，本文對牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物藥物殘留的樣品前處理法進(jìn)行了改進(jìn)，減小基質(zhì)干擾，從而提高檢測的準(zhǔn)確度，從源頭上保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀配熒光檢測器(Waters公司)；XP205分析天平(瑞士Mettler Toledo 公司)；N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation)；SIGMA 3-30K離心機(德國SIGMA公司)； MS3 basic渦旋混合器(IKA)。阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑亞砜，含量均大于98.3%，購于Dr. Ehrenstorfer公司，阿苯達(dá)唑氨基砜對照品，購于德國WITEGA；Waters Oasis MCX 固相萃取柱(6mL/150 mg)；Supelco酸性氧化鋁固相萃取柱(3 mL/1 g)。甲醇、乙腈、乙酸銨(色譜純)；二甲基亞砜(DMSO)、碳酸鈉、焦亞硫酸鈉、乙酸乙酯、正己烷、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、氨水、冰醋酸(分析純)；實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)制備的去離子水。

0.5 mol/L乙酸銨溶液：取1.927 g乙酸銨，用水溶解并稀釋至500 mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑亞砜和阿苯達(dá)唑氨基砜標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別于100 mL容量瓶中，用乙腈:二甲基亞砜(9:1)溶解并定容，配制成濃度為0.1 mg/mL的阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑亞砜和阿苯達(dá)唑氨基砜標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20 ℃以下保存，有效期1個月。

1.3 樣品前處理 稱取試樣(2±0.02)g于50 mL離心管中，加2%的碳酸鈉溶液0.5 mL， DMSO 1 mL和0.004 g/mL焦亞硫酸鈉溶液溶液1 mL，渦旋1 min，加入乙酸乙酯10 mL，渦旋1 min，振蕩5 min， 10000 r/min離心5 min，取上清液。殘渣再加入乙酸乙酯10 mL，渦旋1 min，振蕩5 min， 10000 r/min離心5 min，取上清液。合并兩次上清液，40 ℃氮吹至近干，用正己烷5 mL復(fù)溶，加入乙腈∶0.2 mol/L鹽酸(V∶V/9∶1)2 mL溶液，渦旋1 min，靜置分層，棄去上層正己烷，余液作為備用液1。

酸性Al2O3固相萃取柱依次用乙腈∶0.2 mol/L鹽酸(V∶V/9∶1)溶液3 mL、1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液3 mL活化，取備用液1過柱，收集流出液，用乙腈∶0.2 mol/L鹽酸(V∶V/9∶1)1 mL溶液淋洗，合并流出液，加0.2 mol/L鹽酸溶液8 mL，混勻作為備用液2。MCX柱依次用甲醇3 mL、1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液3 mL、水3 mL、0.2 mol/L鹽酸溶液3 mL活化，取備用液2過柱，待全部液體流出后，依次用0.2 mol/L鹽酸溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，抽干1 min，10%氨化乙腈溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，于40 ℃水浴氮氣吹干。用乙腈∶甲醇∶0.5 mol/L乙酸銨溶液(V∶V∶V/2∶2∶8)1 mL溶解殘余物，過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜測定(上機溶液應(yīng)在72 h內(nèi)完成測定)。

1.4 液相色譜參考條件 色譜柱：Waters Xbridge C18 (4.6×150 mm, 5 μm)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動相A為乙腈，B為甲醇,C為0.5 mol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序見表1。激發(fā)波長290 nm,發(fā)射波長330 nm。

表1 流動相梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍 準(zhǔn)確移取阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑亞砜和阿苯達(dá)唑氨基砜標(biāo)準(zhǔn)溶液液適量，用乙腈∶甲醇∶0.5 mol/L乙酸銨(V∶V∶V/2∶2∶8)溶液稀釋，配置成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，以色譜峰平均峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 藥物回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 方法的靈敏度 添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白樣品中，經(jīng)提取后測定，依據(jù)信噪比S/N>3(按PtP算)，確定阿苯達(dá)唑及其代謝藥物的檢出限均為0.025 mg/kg。依據(jù)信噪比S/N>10(按PtP算)，確定阿苯達(dá)唑及其代謝藥物的定量限均為0.05 mg/kg。2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度考察 本方法考察了在牛肉、牛肝、羊肉、羊肝中的添加回收情況。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在空白樣品中添加0.05、2.5、5、10 mg/kg 4個不同濃度的阿苯達(dá)唑及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度試驗，各濃度進(jìn)行5個樣品平行試驗，重復(fù)3次，求相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，計算結(jié)果見表3。

表3 牛、羊組織中阿苯達(dá)唑及代謝物回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

從表中可以看出，本方法在空白牛羊組織中進(jìn)行0.05～10 mg/kg的添加，平均回收率在60.6%～119.1%之間，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～19.1%之間。說明該方法有較好的準(zhǔn)確度與精密度。阿苯達(dá)唑及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白及添加色譜圖分別見圖1～圖3。

3 討論與小結(jié)

3.1 儀器條件 阿苯達(dá)唑及其代謝物屬于苯并咪唑類物質(zhì)，既有紫外吸收又有熒光吸收。因此，按照參考文獻(xiàn)方法分別選用紫外檢測器和熒光檢測器作為阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢測，實驗結(jié)果表明選用熒光檢測器對動物組織樣品測定時，雜質(zhì)干擾小，準(zhǔn)確度高。因此，選擇熒光檢測器作為動物組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢測器。

阿苯達(dá)唑類藥物殘留檢測常用的流動相體系有甲酸-乙腈和乙酸銨-乙腈-甲醇等流動相體系，試驗過程中對兩種流動性體系進(jìn)行了比較，最終確定了用0.05 mol/L乙酸銨-乙腈-甲醇(80∶10∶10)作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，能夠很好的控制阿苯達(dá)唑氨基砜、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜和阿苯達(dá)唑的保留時間，避免了出峰較早易受到雜質(zhì)峰干擾，也克服了保留時間較長而導(dǎo)致色譜峰展寬。

圖1 阿苯達(dá)唑及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(100 μg/L)

圖2 羊肝組織空白試樣色譜圖

圖3 羊肝組織空白添加阿苯達(dá)唑及其代謝物色譜圖(0.05 mg/kg)

3.2 提取條件 本方法參考了相關(guān)文獻(xiàn)和檢測方法，提取液分別用乙腈、乙酸乙酯和乙腈+乙酸乙酯(V∶V/3∶1)為提溶劑進(jìn)行5次平行提取實驗。由實驗結(jié)果可知，對于四種藥物的提取效率為乙酸乙酯>乙腈+乙酸乙酯>乙腈，同時用乙酸乙酯作為提取溶劑時雜質(zhì)干擾明顯低于乙腈。因此，選用乙酸乙酯為動物組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物的提取溶劑。由于阿苯達(dá)唑及其代謝物具有弱堿性，在不同的鹽溶液和pH 條件下電離度不同，所以參考了國內(nèi)外一些文獻(xiàn)在乙酸乙酯提取溶液中加入5% NaOH、10% Na2SO4和2%Na2CO3，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取溶劑中加入0.5 mL 2%Na2CO3使提取液呈弱堿性，在該條件下阿苯達(dá)唑及其三種代謝物均有較高的回收率。為了減小基質(zhì)對阿苯達(dá)唑及其代謝藥物檢測的干擾，在提取時加入1 mL抗氧化劑Na2S2O5(4 mg/mL)。

3.3 凈化方法 參照文獻(xiàn)的凈化方法，先后比較了Sep-Pak C18(6 mL 150 mg)、Oasis MCX(6 mL 150 mg)、Oasis HLB(6 mL 150 mg)、ProElut SCX(6 mL 150 mg)固相萃取柱，結(jié)果表明MCX回收率最高。但由于樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，僅過MCX柱凈化，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，尤其組織樣品中極性化合物和陰離子化合物會影響動物組織中痕量的阿苯達(dá)唑及其代謝物的檢出。因此，最終選用酸性Al2O3和MCX固相萃取柱作為凈化柱。

該方法具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，適用于牛羊組織中阿苯達(dá)唑及其代謝物殘留量的測定。

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(編輯：侯向輝)

Determination of Albendazole and Its Main Metabolites Residues in Cattle and Ovine Tissues by HPLC-FLD

WU Ning-peng1，PENG Li1，MENG Lei1，CHEN Yan-long2，MA Hao-xuan3(1.HenanInstituteofVeterinaryDrugandFeedsControl,Zhengzhou450008，China;2．ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000，China;3．HenanProvinceZhengzhouNo.7MiddleSchool,Zhengzhou450008，China)

A method based on high performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLD) has been developed for the determination of albendazole and its main metabolites residues in cattle and ovine tissues. The analytes were extracted with ethyl acetate, and cleaned by Alumina-A and MCX solid phase extraction cartridges. Quantification of the analytes were achieved by HPLC-FLD using external standard method. The calibration curves of the drugs were linear in the concentration ranges of 5～2000 μg/L with correlation coefficients more than 0.999. Detection limits and quantification limits of the method for the analytes were 0.025 mg/kg and 0.05 mg/kg in cattle and ovine tissues. The average recoveries ranged from 60.6% to 119.1% at the spiked level of 0.05～10 mg/kg in tissues. The relative standard deviation was in the range of 1.7%～19.1%. With the advantages of good anti-interference ability and sensitivity, the method adapts to the determination of albendazole and its main metabolites residues in cattle and ovine tissues.

cattle and ovine tissues; albendazole and its main metabolites；HPLC-FLD

2016-10-10

A

1002-1280 (2017) 02-0035-05

S859.84

2016年國家畜禽產(chǎn)品未知危害因子識別與已知危害因子安全性評估項目(GJFP2016007)

吳寧鵬，高級獸醫(yī)師，從事獸藥質(zhì)量監(jiān)測與監(jiān)督研究。E-mail:wnppeking2002@163.com