王玉坤，楊航，馮將，魏玉好，易瓊，王魯*(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 55005；.貴州省生化工程中心，貴陽 55005；.河南金泰生物技術(shù)股份有限公司，鄭州 450000)

Ilk對LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細胞分泌炎性因子的影響

王玉坤1,2，楊航3，馮將1,2，魏玉好1,2，易瓊2，王魯2*
(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省生化工程中心，貴陽 550025；3.河南金泰生物技術(shù)股份有限公司，鄭州 450000)

為探究Ilk對LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細胞(MECs)分泌炎性因子IL-8、TNF-α的影響，采用siRNA技術(shù)篩選最佳轉(zhuǎn)染條件，qPCR法和ELISA法檢測siRNA轉(zhuǎn)染后下游蛋白Akt1的表達來評價Ilk沉默，ELISA法檢測Ilk沉默后對小鼠MECs分泌炎性因子IL-8、TNF-α的影響。結(jié)果顯示：選用Ilk-mus-595片段的20 nM轉(zhuǎn)染組可極顯著抑制Ilk的mRNA表達(P<0.01)，轉(zhuǎn)染效率最好，達84.83%；Ilk轉(zhuǎn)染后可顯著減少LPS介導(dǎo)的Akt1 mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(P<0.05)；可顯著減少LPS介導(dǎo)的TNF-α分泌(P<0.05)，但各組IL-8的量無變化(P>0.05)。結(jié)果提示：利用siRNA成功轉(zhuǎn)染的Ilk可以影響細胞內(nèi)Akt1的表達，降低細胞分泌的TNF-α含量，Ilk可能與小鼠MECs的抗炎有關(guān)，可作為靶基因進行更加深入的研究，以期為乳腺炎癥的治療提供新的思路及數(shù)據(jù)參考。

乳腺上皮細胞；Ilk基因；炎性因子

整合素連接激酶(integrin-linked kinase，Ilk)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在全身多種組織均表達，可參與生物體內(nèi)多種信號通路并發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。目前研究表明，Ilk作為一種癌基因與許多腫瘤的形成、凋亡、黏附、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]，研究還表明Ilk與LPS介導(dǎo)腫瘤細胞高表達炎性細胞因子IL-6有關(guān)[3]。有文獻報道乳腺上皮細胞(MECs)在病原微生物侵入乳腺時，能分泌細胞炎性因子，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α[4]，進而趨化中性粒細胞進入乳腺感染區(qū)，抵抗病原菌的感染[5]，產(chǎn)生炎性因子與LPS刺激有關(guān)[6]。通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激下小鼠MECs上Ilk mRNA的表達發(fā)生了顯著變化[7]，然而，Ilk與LPS誘導(dǎo)乳腺上皮細胞分泌細胞炎性因子TNF-α和IL-8是否相關(guān)卻未見報道。本研究利用Ilk siRNA轉(zhuǎn)染小鼠乳腺上皮細胞沉默Ilk基因，探討Ilk的表達對LPS 誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細胞分泌IL-8和TNF-α的影響，以期找到與乳腺炎癥相關(guān)的關(guān)鍵靶點，這對乳腺炎癥等相關(guān)疾病的治療具有重要的意義，也為新藥的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 實驗動物 SPF級3月齡的妊娠中期昆明小白鼠，體重(32±2)g，購自解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心(動物許可證號：SCXK(渝) 2012-0003)，由貴州大學(xué)貴州省生化工程中心SPF級動物實驗室(動物許可證號：SYXK(渝) 2013-0001)飼養(yǎng)。

1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)，Thermo scientific公司；小鼠表皮生長因子(rhEGF)，SAB公司；胰島素(Insulin)、L-谷氨酰胺、霍亂毒素(CT)、脂多糖(LPS)，Sigma公司；I型膠原酶和II型膠原酶，Solarbio公司；Power SYBR Green PCR Master Mix，AB公司；動物組織/細胞RNA提取試劑盒，2×EsTaq MasterMix，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；mouse TNF-α ELISA kit、mouse IL-8 ELISA kit，武漢基因美生物公司；

1.3 實驗儀器 ThermoFisher 8000儲水型CO2細胞培養(yǎng)箱、MultiskanGo型全波段酶標(biāo)儀，Thermo公司；qTOWER實時熒光定量RT-PCR儀，德國jena公司；T100 Thermal Cycler溫度梯度PCR儀、GelDoc XR+ 凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD公司。

2 方 法

2.1 細胞的制備 參照文獻方法[4]，選用3月齡的妊娠中期昆明小鼠1只，壓頸處死小鼠，解剖并分離小鼠乳腺組織，用眼科剪將乳腺組織剪為1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊。用混合酶消化液8 mL將乳腺組織轉(zhuǎn)移到25 mL的三角錐形瓶中，密封放入37 ℃水浴鍋中消化1 h，終止消化后將細胞消化液用細胞篩(160目)過濾，收集濾液，1000 r/min離心5 min，棄上清，在離心管中加入適量含10%FCS/DMEM/F12培養(yǎng)液懸浮細胞團。采用差速貼壁法純化細胞后，將細胞懸液重新轉(zhuǎn)移入細胞培養(yǎng)瓶中，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，隔24 h換液1次，培養(yǎng)4 d。

2.2 實時熒光定量RT-PCR篩選Ilk的siRNA最佳轉(zhuǎn)染條件 按2.1項方法制備小鼠MECs，將100 μL 5×105個/mL的細胞懸液加入24孔細胞培養(yǎng)板中，另加培養(yǎng)液400 μL，在5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使用動物組織/細胞RNA提取試劑盒提取細胞的RNA，盡快用TIANScriptcDNA第一鏈合成試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄，并于-80 ℃保存?zhèn)溆?。從GeneBank獲得Ilk基因序列，使用Primer 5.0設(shè)計引物，以Gapdh為內(nèi)參基因，采用梯度PCR技術(shù)檢測基因的最佳退火溫度(表1)。

表1 qPCR 的引物序列及退火溫度

表2 siRNA序列

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中小鼠Ilk的mRNA序列設(shè)計了2條siRNA片段(表2)。于轉(zhuǎn)染前24 h，接種適當(dāng)數(shù)量的小鼠MECs至24孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長至30%～50%融合時，分別將轉(zhuǎn)染片段加入細胞,使其各組終濃度分別為50 nM、30 nM、20 nM,另設(shè)空白對照組，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，按照2.2項方法提取各孔細胞總RNA，將獲得的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10 μL反應(yīng)體系中，加入5 μL SYBR Green，2 μL模板cDNA，0.8 μL引物，用無RNase的水補充體積至10 μL。然后進行PCR反應(yīng)和熒光測定。熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)熱5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，自變性開始三步為一個循環(huán)，共設(shè)40個循環(huán)；72 ℃延伸2 min，使產(chǎn)物延伸完全。反應(yīng)結(jié)束后自50～95 ℃繪制溶解曲線。測定結(jié)果使用2-△△Ct法進行相對定量，計算轉(zhuǎn)染效率，根據(jù)轉(zhuǎn)染率篩選最佳轉(zhuǎn)染條件。其中：(1)△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)轉(zhuǎn)染后-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)轉(zhuǎn)染前；(2)轉(zhuǎn)染率=1-2-△△Ct。

2.3 Ilk轉(zhuǎn)染效果評價

2.3.1 實時熒光定量RT-PCR檢測Ilk轉(zhuǎn)染后下游蛋白Akt1 mRNA表達量 將適當(dāng)濃度的小鼠MECs細胞接于12孔細胞培養(yǎng)板(共接2塊板)，待其生長至50%融合，設(shè)置4個實驗組：轉(zhuǎn)染組、NC組、脂質(zhì)體組、正常對照組，轉(zhuǎn)染組選用RT-PCR結(jié)果篩選出的最佳有效siRNA的濃度，NC組(陰性對照組)選用NC片段，脂質(zhì)體組只選用轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后，抽去各孔中的培養(yǎng)基，加入終濃度為10 μg/mL含LPS生長培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按2.2項抽提各孔的總RNA，反轉(zhuǎn)錄，采用實時熒光定量RT-PCR測定Akt1 mRNA的轉(zhuǎn)錄量。

2.3.2 ELISA法檢測Ilk轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)Akt1蛋白量 按2.3.1項方法對小鼠MECs采用相同處理，培養(yǎng)完成后，每孔取上清液，按照ELISA試劑盒說明書的方法，分別測定細胞內(nèi)Akt1的蛋白量。

2.4 ELISA法檢測Ilk轉(zhuǎn)染后細胞分泌TNF-α、IL-8量 按2.3.1項方法對小鼠MECs采用相同處理，培養(yǎng)完成后，每孔取上清液，按照ELISA試劑盒說明書的方法，分別測定細胞分泌的TNF-α、IL-8的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 Ilk的siRNA最佳轉(zhuǎn)染條件篩選結(jié)果 結(jié)果如圖1、圖2顯示，與空白組比較，各轉(zhuǎn)染組Ilk mRNA的表達量均顯著下降(P<0.05)。其中Ilk-mus-595片段在50 nM、30 nM、20 nM濃度下的轉(zhuǎn)染效率分別為76.97%、63.52%、84.83%，與空白組相比Ilk的mRNA表達均被極顯著抑制(P<0.01)；Ilk-mus-763片段在50 nM、30 nM、20 nM的轉(zhuǎn)染效率分別為51.29%、53.90%、37.88%，其中50 nM和30 nM濃度下與空白組相比Ilk的mRNA表達均被極顯著抑制(P<0.01)，20 nM濃度下Ilk的mRNA表達被顯著抑制(P<0.05)。比較各組轉(zhuǎn)染率，Ilk-mus-595片段的20 nM濃度下轉(zhuǎn)染率最高。

圖1 RT-PCR法檢測Ilk相對轉(zhuǎn)錄水平

圖2 Ilk-mus-595和Ilk-mus-763片段各組小鼠MECs轉(zhuǎn)染率(**與空白組相比，P<0.01；*與空白組相比，P<0.05)

3.2 Ilk轉(zhuǎn)染后對下游蛋白Akt1影響的結(jié)果3.2.1 Ilk轉(zhuǎn)染后Akt1 mRNA表達量結(jié)果 如圖3所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組中Akt1的mRNA表達量降低了20.2%，且差異顯著(P<0.05)，而NC組和脂質(zhì)體組的表達量與對照組相比基本沒有變化。

圖3 RT-PCR法檢測Akt1相對轉(zhuǎn)錄水平(** 與對照組相比，P<0.01；* 與對照組相比，P<0.05)

3.2.2 Ilk轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)Akt1蛋白量結(jié)果 如圖4顯示，同對照組相比，轉(zhuǎn)染組Akt1的含量顯著性降低(P<0.05)，而NC組和脂質(zhì)體組的蛋白量與對照組相比基本沒有變化。

圖4 ELISA 法檢測細胞分泌Akt1的水平

3.3 Ilk轉(zhuǎn)染后細胞分泌TNF-α、IL-8量的結(jié)果 如圖5顯示，同對照組相比，轉(zhuǎn)染組TNF-α的含量顯著性降低(P<0.05)，而NC組和脂質(zhì)體組與對照組相比基本無變化；圖6結(jié)果顯示，同對照組相比，轉(zhuǎn)染組IL-8的含量無顯著性降低(P>0.05)，不具有統(tǒng)計學(xué)意義，NC組和脂質(zhì)體組與對照組相比基本無變化。

圖5 各組TNF-α含量

圖6 各組IL-8含量(*與對照組相比，P<0.05)

4 討論與小結(jié)

整合素連接激酶在全身的多種組織廣泛表達，尤其在骨骼肌和心臟中高表達，因其自身三個結(jié)構(gòu)域作用，使得Ilk成為整合素信號通路中的關(guān)鍵激酶，介導(dǎo)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)對細胞的調(diào)控，從而參與細胞的增殖、遷移、葡萄糖代謝等多個方面的調(diào)控[8]，還與血管發(fā)育、腫瘤血管生成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、心肌肥厚以及細胞免疫等相關(guān)[9]。研究還表明Ilk與LPS介導(dǎo)腫瘤細胞高表達炎性細胞因子IL-6有關(guān)。LPS是存在于革蘭氏陰性菌上的PAMP，它能與免疫細胞膜上的模式受體相互作用，激活胞內(nèi)TLR4信號通路相關(guān)分子的活化。通過基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)LPS可引起PI3K/Akt信號通路的活化[7]，提示TLR4信號通路與PI3K/Akt信號通路可能會相互影響，調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答。因此猜測，PI3K/Akt信號通路也可能會調(diào)控細胞因子的分泌，因Ilk分子是該通路的主要參與者，為此嘗試探究Ilk能否成為調(diào)控關(guān)鍵炎性細胞因子分泌的新靶向基因。

研究發(fā)現(xiàn)，Akt1作為Ilk重要的作用底物，其上游基因Ilk的激活能直接引起Akt1的磷酸化。據(jù)報道，腫瘤抑制因子PTEN突變的人前列腺癌細胞中Ilk活化可引起Akt1的磷酸化；而抑制Ilk可以抑制Akt1的磷酸化，并誘導(dǎo)細胞周期停滯進而發(fā)生凋亡[10]。有報道PI3K異性抑制劑可以顯著的抑制LPS刺激后肝臟內(nèi)Akt1活化，并降低肝細胞核SREBP-1c的活化，說明LPS可以通過TLR4和PI3K信號通路介導(dǎo)肝臟Akt1的磷酸化[11]；另有研究表明LPS刺激過表達ILK的A549細胞后，細胞因子的表達也呈現(xiàn)顯著的增高，提示外源性炎癥因子LPS與A549細胞表面TLR4結(jié)合后，促進了A549細胞產(chǎn)生炎性細胞因子IL-6[12]。這一系列研究都表明PI3K/Akt信號通路與LPS刺激信號通路的活化關(guān)系密切，也為本試驗研究奠定了理論基礎(chǔ)。

為了明確Ilk基因的沉默是否會影響LPS刺激下小鼠MECs中PI3K/Akt信號通路的活化，本試驗利用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制了基因Ilk的表達，結(jié)果顯示與LPS刺激組相比，轉(zhuǎn)染組顯著下調(diào)了Akt1的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，這說明Ilk表達被抑制之后影響了下游Akt1的表達；通過檢測轉(zhuǎn)染后的蛋白水平，結(jié)果顯示其表達量有所下降，說明Ilk的表達抑制，會對其下游的靶點Akt1產(chǎn)生一定的影響，這與腫瘤細胞的報道一致[9]。PI3K/Akt信號通路會受到干擾，是否會影響炎性因子的表達？本研究進一步測定了TNF-α和IL-8的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因Ilk表達被抑制后，上清液中IL-8含量幾乎沒有變化；而TNF-α含量顯著降低 (P<0.05)。結(jié)果說明，抑制基因Ilk的表達，從而抑制了其下游基因Akt1的活性，PI3K/Akt信號通路的下調(diào)對TLR4信號通路的持續(xù)活化有一定的干擾作用，進而抑制NF-κB的活化，最終降低細胞分泌細胞因子TNF-α的減少，進而可減輕LPS引起小鼠MECs炎性反應(yīng)時對細胞的損傷。然而其為何只影響TNF-α的分泌，對IL-8分泌沒有影響的現(xiàn)象有待進一步深入研究。

[1] 儲昭節(jié),周健,惠延年.ILK siRNA對高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的人LECs增生和上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用[J].眼科研究,2009，27(5):353-357.

[2] 趙勇.ILK-整合素信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵激酶[J].國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊,2001,23(6):366-369.

[3] 劉璟,陳全,陳炎,等.ILK對LPS誘導(dǎo)肺癌A549細胞分泌免疫逃逸相關(guān)因子的影響[J].免疫學(xué)雜志,2013,29 (4):291-295.

[4] 易瓊. 小鼠乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)及其天然免疫功能的探究[D]. 貴陽：貴州大學(xué), 2012.

[5] Pareek R,Wellnitz O,VanDorp R,etal.Immunorelevant gene expression in LPS-challenged bovine mammary epithelial cells[J].J Appl Genet,2005,46(2):171-177.

[6] 李欣,李中改,張小藝,等.金英黃歸湯對LPS介導(dǎo)乳腺上皮細胞TLR4信號通路中相關(guān)因子的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2016,47(3):609-614.

[7] 楊航.小鼠乳腺上皮細胞TLR4信號途徑的研究[D]. 貴陽：貴州大學(xué),2013.

[8] 王曉紅.ILK在SD大鼠皮膚燒傷創(chuàng)面愈合過程中的作用[D]. 貴陽：暨南大學(xué),2014.

[9] Ho B,Bendeck M P.Intergrin linked kinase(Ilk)expression and function in vascular smooth muscle cell[J].Cell AdhMigar，2009,3(2):174-176.

[10]Persad S, Attwell S, Gray V,etal. Inhibition of integrin-linked kinase(ILK) suppressesactivation of protein kinase B/Akt and induces cell cycle arrest and apoptosis of PTEN-mutant prostate cancer cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(7): 3207-3212.

[11]張志輝. TLR4/MyD88介導(dǎo)的PI3K/Akt信號在調(diào)節(jié)小鼠肝臟糖脂代謝中的作用 [D]. 安徽: 安徽醫(yī)科大學(xué), 2013.

[12]孫曉杰,林梁,趙玫,等.ILK與HSP90相互作用對乳腺癌細胞遷移影響及其機制的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2012,19(3):161-165.

(編輯：侯向輝)

Effects of ILK on Secretion of IL-6 and TNF-α in LPS-stimulated Mammary Epithelial Cell

WANG Yu-kun1,2,YANG Hang3,FENG Jiang1,2,WEI Yu-hao1,2,YI Qiong2,WANG Lu2*
(1.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China；2．BiochemicalEngineeringCenterofGuizhouProvince,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;3．HenanJintaiBiologicalStockLimitedCorporation,Zhengzhou450000,China)

To investigate the effect of Ilk on secretion of IL-8 and TNF-α in LPS-stimulated mammary epithelial cells (MECs)，Ilk gene was transfected with RNA interference, then the best transfection concentration was obtained by real-time quantitative RT-PCR. Meanwhile, the transfection efficiency was evaluated by the Akt1 relative transcript levels assayed by RT-PCR and the content of Akt1 protein measured by ELISA.The content of IL-8 and TNF-α in the mouse MECs were measured by ELISA.The results showed that the transfection efficiency of Ilk-mus-595 in 20 nM was highest (84.83%),which could significantly inhibited Ilk mRNA expression(P<0.01). When the mouse MECs was transfected with siRNA of Ilk and stimulated with LPS, compared with the control group, the expression of Akt1 mRNA and protein was significantly reduced after the silence of Ilk gene (P<0.05). The secretion of TNF-α was prominently reduced (P<0.05), but there was no change (P>0.05) on the IL-8 content in each group.These results indicated that the silence of Ilk could change the expression of Akt1 and reduce the secretion of TNF-α in LPS-stimulated MECs, which proved that its anti-infection effect maybe related to Ilk,so Ilk could be chosen as a target gene to further explore the immune function of mouse MECs. Which can provide new train of thought and experimental data for treatment of mammary gland inflammation and provide theoretical basis for the development and application of new drugs.

MECs;Ilk; cytokine

2016-10-08

A

1002-1280 (2017) 02-0059-05

S852.331

國家自然科學(xué)基金項目(31260618; 31470128)

王玉坤，碩士研究生，從事中獸醫(yī)學(xué)及中藥藥理研究。

王魯。E-mail:wanglu7007@163.com