王愛(ài)麗 徐順 顧耀輝 黃靜 賈卿 陳波

苦參素抑制裸鼠人源增生性瘢痕的初步研究

王愛(ài)麗 徐順 顧耀輝 黃靜 賈卿 陳波

目的探討苦參素對(duì)裸鼠人源增生性瘢痕膠原合成和纖維化的抑制作用。方法將人源增生性瘢痕移植到裸鼠背部（n=30），構(gòu)建增生性瘢痕裸鼠模型。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、苦參素涂膜劑組和陽(yáng)性藥組，術(shù)后10 d開(kāi)始分別涂抹空白涂膜劑、苦參素和醋酸曲安奈德涂膜劑，每天2次，連續(xù)8周。每周觀察并拍照，記錄瘢痕生長(zhǎng)情況，于術(shù)后10 d，以及用藥后35 d、49 d和56 d時(shí)測(cè)量瘢痕面積；HE染色觀察組織形態(tài)；RT-PCR檢測(cè)瘢痕中α-SM-Actin和Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)。結(jié)果涂抹藥物35 d、49 d和56 d，苦參素涂膜劑組瘢痕面積顯著縮小，與空白對(duì)照組和陽(yáng)性藥組相比差異顯著（P＜0.05）；RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，苦參素涂膜劑組和陽(yáng)性藥組的α-SM-Actin與Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論苦參素涂膜劑對(duì)增生性瘢痕膠原合成有明顯抑制作用，并具有抗瘢痕纖維化的作用?！娟P(guān)鍵詞】苦參素涂膜劑增生性瘢痕纖維化

瘢痕增生導(dǎo)致外形異常和功能障礙，給患者帶來(lái)極大的痛苦[1-2]。增生性瘢痕是真皮損傷后組織異常修復(fù)的結(jié)果，以成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度纖維化為特征。其形成機(jī)制不明，尚缺乏有效的治療手段[3]?？鄥⑺鼐哂锌寡?、免疫調(diào)節(jié)和抗肝纖維化作用，用于慢性乙肝的治療[4-5]。而增生性瘢痕是皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中的一種過(guò)度纖維化病變。研究證實(shí)，苦參素在體外能抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖[6]，且使細(xì)胞外基質(zhì)合成下降[7]，細(xì)胞凋亡增多[8]。我們的前期研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)[9]。本實(shí)驗(yàn)中，我們將人源增生性瘢痕組織移植到裸鼠背部，使用苦參素涂膜劑涂抹瘢痕，觀察苦參對(duì)瘢痕的抑制作用和抗纖維化作用，探討苦參素外用制劑用于增生性瘢痕的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物

苦參素涂膜劑[10]：先分別制取苦參的水煎提取物、乙醇提取物，兩者等比例混合，再按提取物30%、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）15%、乙醇30%、甘油20%、氮酮0.5%、蒸餾水4.5%制備涂膜劑，消毒后常溫封閉儲(chǔ)存。

醋酸曲安奈德涂膜劑：取醋酸曲安奈德（1∶100）溶入空白涂膜劑，消毒后常溫封閉儲(chǔ)存。

空白涂膜劑：PVP45%、乙醇30%、甘油20%、氮酮0.5%、蒸餾水4.5%制備涂膜劑，消毒后常溫封閉儲(chǔ)存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

單純T淋巴細(xì)胞缺陷（BALB/C-nunu品系）裸鼠（上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心），雄性，6～7周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF級(jí)層流架飼養(yǎng)。

1.1.3 儀器與試劑

數(shù)碼相機(jī)、光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），BCA蛋自定量試劑盒（碧云天生物科技有限公司），RNA提取試劑盒、PCR引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），鼠抗人α-SM-Actin和Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），RT-PCR、Western blot檢測(cè)設(shè)備（美國(guó)Bio-ard公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建

裸鼠瘢痕模型的制備：取人源增生性瘢痕組織標(biāo)本，修剪并去除皮下脂肪組織，分成2.0 cm×2.0 cm、厚約0.25 cm的小塊，0.9%生理鹽水浸潤(rùn)備用。去除裸鼠背部2.0 cm×2.0 cm全層皮膚，將上述瘢痕標(biāo)本移植于皮膚缺損處，對(duì)稱均勻吻合，間斷縫合4～6針，打包加壓包扎。術(shù)后放回?zé)o菌層流架繼續(xù)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件同術(shù)前。每天在移植皮膚處滴加生理鹽水以保持創(chuàng)面和移植皮片的濕潤(rùn)，10 d后拆線。

1.2.2 動(dòng)物分組與用藥

將30只裸鼠瘢痕模型隨機(jī)分為苦參素涂膜劑組10只、陽(yáng)性藥組（醋酸曲安奈德涂膜劑）10只和空白對(duì)照組10只，分籠飼養(yǎng)于無(wú)菌層流架。于手術(shù)后10 d瘢痕生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)（即拆線后）開(kāi)始用藥。分別將制成的涂膜劑涂抹在裸鼠模型背部增生性瘢痕區(qū)域，涂抹時(shí)按照無(wú)菌操作規(guī)范進(jìn)行，藥物用量適中，即能在瘢痕表面形成一層薄膜即可；涂抹范圍較瘢痕范圍略寬。每天2次，持續(xù)用藥8周。

1.2.3 瘢痕面積的測(cè)量

首先用剪耳的方法標(biāo)記裸鼠，然后使裸鼠背部皮膚處于自然狀態(tài)且充分暴露下，用精確到0.2 mm的游標(biāo)卡尺測(cè)量瘢痕組織的長(zhǎng)、寬，測(cè)量時(shí)間為術(shù)后10 d，以及用藥后35 d、49 d和56 d。

1.2.4 組織學(xué)觀察

于上述時(shí)間點(diǎn)對(duì)裸鼠瘢痕組織行組織學(xué)觀察。取裸鼠部分背部瘢痕組織置于10%中性福爾馬林中固定24 h；流水沖洗至少5 h；按75%、85%、95%、100%、100%乙醇梯度脫水1 h、50 min、30 min、30 min、30 min；先放入無(wú)水乙醇和二甲苯各半的混合液浸泡15～30 min，純二甲苯中透明；石蠟包埋，切片（40 μm厚）；HE染色，鏡下觀察。

1.2.5 PCR檢測(cè)瘢痕組織中細(xì)胞因子的含量變化

將瘢痕組織剪碎，裂解，抽提總RNA，合成cDNA（2 μg RNA/20 μL體系，TaKaRa AMV Reverse Transcriptase XL），進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列：①collagenⅠ，正義鏈5’-GGCGGCCAGGGCTCCGACCC-3’，反義鏈5’-AATTCCTGGTCTGGGGCACC-3’，產(chǎn)物片段319 bp；②collagenⅢ，正義鏈5’-TGGTGTTGGAGCCGCTGCCA-3’，反義鏈5’-CTCAGCACTAGAACTTGTCC-3’，產(chǎn)物片段346 bp；③α-SMActin，正義鏈5’-GGTGATGGTGGGAATGGG-3'，反義鏈5'-GCAGGGTGGGATGCTCTT-3'，產(chǎn)物片段188 bp；④β-actin，正義鏈5’-CGATATGGAGAAGATTTGGCACC-3’，反義鏈5’-TACGACCAGAGGCATACAGGGAC-3’，產(chǎn)物片段203 bp。反應(yīng)條件：熱變性95℃5 min；35個(gè)循環(huán)，94℃45 sec、55℃45 sec、72℃1 min；延伸72℃10 min。反應(yīng)產(chǎn)物于1%Agarose（含0.5 mg/L Ethidium Bromide，EB）進(jìn)行電泳[11]，Gel-Pro Imager Kit（Media Cybernetics）對(duì)各電泳條帶的光密度進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用單側(cè)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠瘢痕模型的建立

將人源增生性瘢痕標(biāo)本移植到裸鼠背部，術(shù)后10 d見(jiàn)瘢痕組織存活，瘢痕呈暗紅色，質(zhì)韌，血運(yùn)良好（圖1）。

2.2 苦參素涂膜劑作用后組織形態(tài)學(xué)變化

將增生性瘢痕標(biāo)本移植到裸鼠背部10 d后拆線，瘢痕組織存活。HE染色見(jiàn)組織致密，膠原排列紊亂；涂抹苦參素56 d后組織學(xué)觀察顯示，真皮層厚度明顯變薄，膠原纖維減少，較疏松，排列相對(duì)整齊（圖2）。

2.3 苦參素涂膜劑作用后增生性瘢痕面積的變化

術(shù)后l0 d瘢痕創(chuàng)面突出皮膚表面，呈暗紅色，較硬。用藥后35 d、49 d和56 d時(shí)，苦參素涂膜劑治療組瘢痕面積顯著縮小，表面趨于平坦，質(zhì)地變軟，顏色變淡，接近于正常膚色，與空白對(duì)照組和陽(yáng)性藥組有顯著差異（P＜0.05）（圖3）。

圖1 裸鼠瘢痕模型的建立Fig.1The establishment of animal models of hypertrophic scar

2.4 苦參素涂膜劑對(duì)增生性瘢痕組織的Ⅰ、Ⅲ型膠原及α-SM-Actin mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，苦參素涂膜劑組和陽(yáng)性藥組作用于瘢痕組織56 d后，瘢痕組織內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原、α-SM-Actin mRNA的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）（圖4、5）。

圖2 增生性瘢痕組織學(xué)觀察Fig.2Histological observation of hypertrophic scar

圖3 不同藥物組各時(shí)間點(diǎn)瘢痕大體觀察Fig.3Gross observation of hypertrophic scar in each group

圖4 苦參素對(duì)增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的影響Fig.4The effect of Oxymatrine on the expression of CollagenⅠ,Ⅲin hypertrophic scar

圖5 苦參素對(duì)增生性瘢痕α-SM-Actin mRNA表達(dá)的影響Fig.5The effect of Oxymatrine on the expression of α-SM-Actin in hypertrophic scar

3 討論

增生性瘢痕是創(chuàng)傷后組織過(guò)度修復(fù)的結(jié)果，在傷口愈合過(guò)程中，由于炎癥反應(yīng)、過(guò)敏、缺氧、內(nèi)分泌紊亂，以及某些生物化學(xué)因素持續(xù)作用于損傷部位，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞活化、增殖、合成膠原并分化異常，直接導(dǎo)致膠原合成與降解的平衡被破壞，膠原的合成明顯超過(guò)降解，致其大量地不規(guī)則堆積，形成增生性瘢痕，其組織學(xué)表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度聚集[12]。另外，皮膚成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，也是導(dǎo)致瘢痕不規(guī)則增生、攣縮的重要因素。因此，增生性瘢痕抗纖維化的中心策略是抑制成纖維細(xì)胞的增殖和分化[13]。研究表明，任何非手術(shù)治療瘢痕的有效方法，均應(yīng)直接或間接針對(duì)抑制成纖維細(xì)胞增殖和調(diào)整膠原代謝異常這一重要環(huán)節(jié)[14]。目前，治療瘢痕的藥物存在許多不足，激素類藥物產(chǎn)生局部、全身的激素樣副作用，鈣離子拮抗劑對(duì)正常皮膚和心血管有影響，硅制劑透氣性能差，易使皮膚產(chǎn)生濕疹甚至潰爛，抗腫瘤藥物細(xì)胞毒作用大，免疫抑制劑及細(xì)胞因子副作用多、價(jià)格貴。

因此，將相對(duì)低毒的中藥應(yīng)用于瘢痕防治，是一種可能的選擇[15]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在防治增生性瘢痕方而的研究較多[15-16]。中醫(yī)認(rèn)為，增生性瘢痕主要有氣血瘀滯、經(jīng)絡(luò)痹阻、痰濕搏結(jié)或三者相輔而成所致，治療以活而化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)為主[17]。丹參、川芍、桃仁、當(dāng)歸、雷公藤、青蒿素等藥物，均被嘗試用于增生性瘢痕的治療，但用藥途徑單一，劑型有限，多集中在單味藥物或是中藥提取物的研究，且以體外研究為主。因此，中醫(yī)藥在防治增生性瘢痕方面的研究還有待突破。

本研究將人源增生性搬痕組織移植到裸鼠背部，使用苦參素涂膜劑涂抹搬痕。結(jié)果表明，苦參素涂膜劑對(duì)增生性膠原合成有明顯抑制作用，并下調(diào)B-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的凋亡，具有抗纖維化的作用，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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The Inhibitory Effects of Oxymatrine Coating Agent on Human Hypertrophic Scar

ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of Oxymatrine coating agent on hypertrophic scar.Methods Human hypertrophic scar tissues were subcutaneously transplanted into the back of 30 nude mice to create the animal model of hypertrophic scar.Ten days after the operation,the mice were distributed into the control group,Oxymatrine coating agent group and positive medicine group,and were treated with blank coating agent,Oxymatrine coating agent and triamcinolone acetonide acetate coating agent respectively.Drugs were applied 2 times a day for 8 weeks.The growth of the scar was observed and photographed every week,and the size was measured 10 days after operation,and 35,49,56 days after drug treatment.HE staining was used for histological observation.RT-PCR and western blot assessment were used to detect the expression of CollagenⅠ,Ⅲand α-SM-Actin.ResultsAfter drug treatment for 35,49 and 56 days,the scar sizes in Oxymatrine coating agent group shrunk obviously and were much smaller compared with control group and positive medicine group(P＜0.05).According to RT-PCR assessment,the expression of CollagenⅠ,Ⅲand α-SM-Actin were declined sharply in Oxymatrine coating agent group and positive medicine group,compared with the control group.ConclusionOxymatrine coating agent has obvious inhibitory effects on hypertrophic scar,and also has anti-fibrosis effect.

Oxymatrine;Coating agent;Hypertrophic scar;Fibrosis

R619+.6

A

1673－0364（2017）01－0009－04

WANG Aili,XU Shun,GU Yaohui,HUANG Jing,JIA Qing,CHEN Bo．
Burn Unit of Shanghai Seventh People's Hospital,Shanghai 200137,China. Corresponding author:XU Shun(E-mail:xushun197901@163.com).

2016年11月20日；

2017年1月12日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.003

上海市浦東新區(qū)衛(wèi)計(jì)委科技發(fā)展專項(xiàng)基金面上項(xiàng)目（PW2013A-25）；上海市中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合臨床重點(diǎn)扶持項(xiàng)目（ZY3-JSFC-1-1014）。

200137上海市上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院燒傷整形科。

徐順（E-mail：xushun197901@163.com）。