趙莉娟 鄭江紅 柳向東 茅廣宇 鄧辰亮 楊松林

iRGD-外泌體-阿霉素抑制惡性黑色素瘤體外增殖的研究

趙莉娟 鄭江紅 柳向東 茅廣宇 鄧辰亮 楊松林

目的探討應用iRGD-外泌體-阿霉素抑制人惡性黑色素瘤細胞系A375體外增殖的有效性及其靶向性。方法體外轉染iRGD，并提取外泌體，通過電穿孔包裹阿霉素，利用流式細胞儀檢測iRGD-外泌體-阿霉素對A375細胞的親和力，并對iRGD-外泌體-阿霉素抑制A375細胞的增殖能力進行分析。結果iRGD-外泌體-阿霉素與A375細胞的結合率高于空白轉染-外泌體-阿霉素；iRGD-外泌體-阿霉素可明顯抑制A375細胞的增殖，空白轉染-外泌體-阿霉素未觀察到明顯的抑制情況。結論iRGD-外泌體-阿霉素能通過靶向作用于A375細胞，并抑制其增殖。

惡性黑色素瘤靶向治療外泌體阿霉素

惡性黑色素瘤（Malignant melanoma，MM）是起源于皮膚黑色素細胞的高度惡性腫瘤，占體表惡性腫瘤的7%～20%，僅次于皮膚鱗癌和基底細胞癌，居第三位[1]。惡性黑色素瘤的發(fā)病機制尚未明確，黑色素細胞痣惡變、病毒感染、紫外線照射等多種因素均與其發(fā)生有關[2]，傳統(tǒng)的手術及放、化療治療效果有限。近年來，外泌體作為一種包裹藥物的特異性載體，可包裹阿霉素等化療藥物，靶向作用于惡性黑色素瘤細胞，降低傳統(tǒng)化療的副作用[3]。其靶向治療優(yōu)勢明顯[4]，免疫原性低、無毒副作用；且來源廣，具有磷脂雙分子層結構，易于與靶細胞的細胞膜融合[5]；分子結構小，納米級分子量（10～100 nm），可避免單核細胞的吞噬作用，且易于穿透腫瘤組織毛細血管向深層組織浸潤[6]。本實驗根據(jù)iRGD可與惡性黑色素瘤表面的αν整合素特異性結合的原理，體外設計iRGD-外泌體，經(jīng)電穿孔包裝阿霉素后靶向結合惡性黑色素瘤細胞表面，經(jīng)胞吞作用將阿霉素攝入腫瘤細胞內，直接有效地起到抗腫瘤效果，并減少對正常細胞的損傷。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人惡性黑色素瘤細胞系A375（以下簡稱為A375），人腎上皮細胞系293T（以下簡稱為293T），均購于中科院上海細胞所；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)液、胰酶、PBS（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；外泌體提取試劑（美國Invitrogen公司）；阿霉素（美國Sigma公司）；熒光染劑DIO（美國Invitrogen公司）。

電穿孔儀（美國Invitrogen公司）；FACS Calibur型流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T細胞，待細胞融合至85%～90%時，傳代培養(yǎng)，收集第6～8代293T細胞用于下一步實驗研究。

1.2.2 質粒構建與細胞轉染

293T細胞接種至六孔板，細胞85%～90%融合時，按Lipofectamine 2000說明書配置溶液A：240 μL無血清DMEM+10 μL Lipofectamine2000；溶液B：233 μL無血清DMEM+17 μL pcDNA3.1（+）-hLAMP2b-CysiRGD質粒。質粒序列：TGCTGTAGAGGTGACAAAGGCCCAGATTGTGGTGGATCATGC。將A、B在5 min內混勻，室溫放置20 min后，每孔各加入2 mL DMEM，A、B混勻后懸滴加入培養(yǎng)液中，標記為空白轉染組（對照組）、iRGD轉染組（實驗組）。搖動培養(yǎng)板輕輕混勻，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換含10%胎牛血清的FBS培養(yǎng)液，24 h后收集上清，提取外泌體。

1.2.3 外泌體的提取

細胞轉染收集上清，2 000 g離心30 min，離心后收集1 mL上清，加入500 μL Total Exosome Isolation reagent，4℃過夜，10 000 g 4℃離心1 h，棄上清，分別獲得空白轉染-外泌體（blank-exo，對照組）、iRGD-外泌體（iRGD-exo，實驗組），沉淀，-20℃保存。

1.2.4 藥物包裝

將0.2 μL外泌體+50 μg阿霉素用buffer混勻（200 μL體系），常溫下1 KV、20 ms電穿孔后4℃保存，分別獲得空白轉染-外泌體-阿霉素（blankexo-dox，對照組）與iRGD-外泌體-阿霉素（iRGD-exo-dox，實驗組）。

1.2.5iRGD的RT-PCR檢測

取凍存外泌體抽提RNA，并將其轉合成為cDNA，進行PCR反應，GAPDH設為管家基因。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性40 sec，40℃退火40 sec，72℃延伸1 min。將EP管放入儀器擴增，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。4℃儲存。用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，并檢測拍照。

GAPDH引物序列：上游5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’；iRGD引物序列：上游TCGATGTTAGACCTGGAAATAGTGGTGCTGTG，下游CCGGCACAGCACCACTATTTCCAGGTCTAACA。

1.2.6A375細胞染色

用含10%胎牛血清的FBS培養(yǎng)液在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩組A375細胞，待細胞65%～70%左右融合時，使用試劑Dio進行細胞染色。使用DMSO配置成1 mM濃度作為儲存液，PBS稀釋200倍至5 μM工作液，將稀釋好的Dio染料懸滴加入A375細胞培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2孵育1 h。PBS溶液清洗染劑，在細胞培養(yǎng)皿中加入10 mL含10%胎牛血清的FBS培養(yǎng)液。

1.2.7 外泌體結合

將獲取的blank-exo-dox、iRGD-exo-dox懸液分別懸滴加入已Dio染色的A375細胞培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2孵育1 h后，PBS清洗3次，去除多余的外泌體，分別得到A組（blank-exo-dox-A375，實驗組）、B組（iRGD-exo-dox-A375，對照組）細胞，分別進行流式細胞儀檢測和細胞增殖檢測。

1.2.8 流式細胞儀檢測

胰酶消化后分別獲取A組和B組細胞懸液，1 000 g離心3 min，棄上清，獲取細胞沉淀，將兩組細胞沉淀分別加入0.9%NaCl，稀釋至1 mL，用于流式細胞儀檢測，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.9 細胞增殖檢測

取96孔板，分別用于檢測A、B組細胞，每孔加入100 μL的A或B細胞懸液（1×104個/孔）。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的條件培養(yǎng)箱中分別孵育0、24、48、72、96 h，向待測孔加入10 μL CCK-8溶液。每組細胞、每個時間點取3個樣品檢測，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育1～4 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

2 結果

2.1iRGD-外泌體的鑒定

我們通過RT-PCR對iRGD mRNA的表達水平進行評估。結果顯示相較于blank-exo，iRGD-exo具有較高水平的iRGD mRNA表達（圖1）。

圖1RT-PCR檢測iRGD的mRNA表達Fig.1The mRNA expression of iRGD detected by RT-PCR

2.2iRGD-外泌體-阿霉素靶向于A375細胞的研究

為了確認iRGD是否靶向于A375細胞上的αν整合肽，我們將blank-exo-dox、iRGD-exo-dox懸液分別懸滴加入已Dio染色的A375細胞培養(yǎng)皿中。流式細胞檢測證實，iRGD-exo-dox與A375細胞的結合效率高于blank-exo-dox（分別為41.5%、8.4%），表明iRGD可特異性結合于A375細胞表面的αν整合素（圖2）。

圖2 流式細胞儀檢測結果Fig.2Results of flow cytometry

2.3iRGD-外泌體抑制A375細胞的效果

使用iRGD-exo-dox與blank-exo-dox對A375細胞進行24、48、72、96 h存活能力分析。CCK-8檢測顯示iRGD-exo-dox抑制了細胞的增殖，但在blank-exo-dox中并沒有觀察到明顯的抑制情況，表明iRGD-exo-dox對A375細胞的增殖有明顯的抑制作用（圖3）。

圖3A375細胞增殖曲線Fig.3The curve of cell proliferation in A375 cells

3 討論

近年的研究認為，靶向治療可直接高效地起到抗腫瘤作用，但靶向治療的瓶頸在于發(fā)現(xiàn)的相關腫瘤的細胞表面特異性抗原有限。目前已發(fā)現(xiàn)的惡性黑色素瘤標志物有：黑色素瘤細胞分化抗原糖蛋白（Glycoprotein，gp）100、黏附分子L1-CAM、人內源性逆轉錄病毒K包膜蛋白（HERV-K）等[7]。這些標志物在多種實體瘤，如惡性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌中均有過度表達，而在正常細胞中表達量極低，它們的相對特異性表達是當前治療相關腫瘤的重要靶點[8-13]。Krishnamurthy等[7]利用HERV-K的腫瘤特異性，構建相關嵌合抗原受體修飾的T細胞（CAR-T），特異性識別HERV-K并與其結合，起到了限制腫瘤生長的效果。

αν整合素是細胞表面的一種黏附分子，主要通過介導細胞與細胞外基質的黏附作用，而影響細胞的生物學行為，在正常細胞表面呈低表達水平，同樣在多種實體瘤細胞表面呈高表達水平，與腫瘤的侵襲、轉移密切相關[14]。乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、惡性黑色素瘤等腫瘤細胞表面均過度表達αν整合素，Tian等[3]利用αν整合素表達的相對特異性，聯(lián)合設計體內和體外實驗，將化療藥物靶向作用于乳腺癌細胞，取得顯著療效。本實驗針對惡性黑色素瘤細胞表面αν整合素的高水平表達，體外構建iRGD-exo-dox顆粒，將阿霉素特異性作用于惡性黑色素瘤細胞（A375細胞），觀察對惡性黑色素瘤體外增殖的影響。

外泌體是由內皮細胞和造血干細胞產生的磷脂雙分子層囊泡，可經(jīng)胞吞作用被細胞攝取，是運輸化療藥物的理想載體[15]。與傳統(tǒng)化療方法相比，經(jīng)外泌體轉載的化療藥物可特異性作用于腫瘤細胞，其納米級（10～100 nm）結構可避免體內單核巨噬細胞的吞噬[6]，可以提高抗腫瘤的效能；同時還能避免對正常細胞的損傷，降低化療的副作用。目前，大量的化療藥物因劑量依賴性副作用而導致應用受限。阿霉素是常見的臨床化療藥物，對腫瘤生長控制有顯著效果，但同時也可廣泛作用于全身正常細胞，而引起心血管系統(tǒng)損傷[16]。本研究在體外構建運載化療藥物（阿霉素）的載體，通過載體與細胞之間的靶向結合直接將藥物作用于腫瘤細胞，安全高效地遏制惡性黑色素瘤的增殖。我們在體外培養(yǎng)293T細胞，待細胞融合率達80%～90%時，體外轉染iRGD，提取外泌體，通過電穿孔包裹阿霉素，利用流式細胞儀檢測iRGD-外泌體-阿霉素對A375細胞的親和力，并對iRGD-外泌體-阿霉素抑制A375細胞的增殖能力進行分析。結果顯示，iRGD-外泌體-阿霉素與A375細胞的結合率高于空白轉染-外泌體-阿霉素，且iRGD-外泌體-阿霉素可明顯抑制A375細胞的增殖，而空白轉染-外泌體-阿霉素未觀察到明顯的抑制作用，說明表達iRGD蛋白的外泌體攜載阿霉素能更有效地抑制細胞增殖，起到抗腫瘤作用。

近年來，惡性黑色素瘤的發(fā)病率逐漸增加，80%皮膚癌的死亡與惡性黑色素瘤相關。常隱匿起病，但進展速度快，早期易發(fā)生轉移，惡性度高，預后差，生存中位數(shù)只有6個月左右[17]。傳統(tǒng)的手術切除、放化療對惡性黑色素瘤的治療效果均不明顯，且截肢術及放化療的毒副作用增加了患者的痛苦。應用外泌體作為藥物載體的靶向治療在提高抗腫瘤效能的同時，也降低了患者放化療的痛苦。外泌體來源廣、免疫原性低，在靶向治療領域中具有廣闊的應用前景。相信隨著更為深入的研究，有望為包括惡性黑色素瘤在內的腫瘤治療，開辟一條高效可行的新途徑。

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The Inhibition of iRGD-Exosomes-Doxorubicin on the Proliferation of Malignant Melanoma in Vitro

ObjectiveTo investigate the effect and targeting of iRGD-exosomes-doxorubicin(iRGD-exo-dox)on the inhibition of A375 cell line.MethodsThe exosomes were extracted from the iRGD-transfected A375 cells.The doxorubicin was wrapped by electroporation.Flow cytometry was used to detect the affinity of iRGD-exo-dox to A375 cells.The ability of iRGD-exo-dox on inhibiting the proliferation of A375 cells was analyzed.ResultsThe affinity of iRGD-exo-dox to A375 cells was higher than the blank-exo-dox.The proliferation of A375 cells was obviously inhibited by iRGD-exo-dox.The inhibition effect was not observed in blank-exo-dox group.ConclusioniRGD-exo-dox can inhibit the proliferation of A375 cells by targeting function.

Malignant melanoma;Targeted therapy;Exosome;Doxorubicin

R739.5

B

1673－0364（2017）01－0025－04

ZHAO Lijuan,ZHENG Jianghong,LIU Xiangdong,MAO Guangyu,DENG Chenliang,YANG Songlin．
Department of Plastic Surgery, Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233,China.Corresponding author:YANG Songlin(E-mail:slyang@sjtu.edu.cn).

16日；

2017年1月22日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.007

200233上海市上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院整形外科。

楊松林（E-mail：slyang@sjtu.edu.cn）。