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        iRGD-外泌體-阿霉素抑制惡性黑色素瘤體外增殖的研究

        2017-03-16 06:51:27趙莉娟鄭江紅柳向東茅廣宇鄧辰亮楊松林
        組織工程與重建外科雜志 2017年1期
        關鍵詞:阿霉素黑色素瘤外泌體

        趙莉娟 鄭江紅 柳向東 茅廣宇 鄧辰亮 楊松林

        iRGD-外泌體-阿霉素抑制惡性黑色素瘤體外增殖的研究

        趙莉娟 鄭江紅 柳向東 茅廣宇 鄧辰亮 楊松林

        目的探討應用iRGD-外泌體-阿霉素抑制人惡性黑色素瘤細胞系A375體外增殖的有效性及其靶向性。方法體外轉染iRGD,并提取外泌體,通過電穿孔包裹阿霉素,利用流式細胞儀檢測iRGD-外泌體-阿霉素對A375細胞的親和力,并對iRGD-外泌體-阿霉素抑制A375細胞的增殖能力進行分析。結果iRGD-外泌體-阿霉素與A375細胞的結合率高于空白轉染-外泌體-阿霉素;iRGD-外泌體-阿霉素可明顯抑制A375細胞的增殖,空白轉染-外泌體-阿霉素未觀察到明顯的抑制情況。結論iRGD-外泌體-阿霉素能通過靶向作用于A375細胞,并抑制其增殖。

        惡性黑色素瘤靶向治療外泌體阿霉素

        惡性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)是起源于皮膚黑色素細胞的高度惡性腫瘤,占體表惡性腫瘤的7%~20%,僅次于皮膚鱗癌和基底細胞癌,居第三位[1]。惡性黑色素瘤的發(fā)病機制尚未明確,黑色素細胞痣惡變、病毒感染、紫外線照射等多種因素均與其發(fā)生有關[2],傳統(tǒng)的手術及放、化療治療效果有限。近年來,外泌體作為一種包裹藥物的特異性載體,可包裹阿霉素等化療藥物,靶向作用于惡性黑色素瘤細胞,降低傳統(tǒng)化療的副作用[3]。其靶向治療優(yōu)勢明顯[4],免疫原性低、無毒副作用;且來源廣,具有磷脂雙分子層結構,易于與靶細胞的細胞膜融合[5];分子結構小,納米級分子量(10~100 nm),可避免單核細胞的吞噬作用,且易于穿透腫瘤組織毛細血管向深層組織浸潤[6]。本實驗根據(jù)iRGD可與惡性黑色素瘤表面的αν整合素特異性結合的原理,體外設計iRGD-外泌體,經(jīng)電穿孔包裝阿霉素后靶向結合惡性黑色素瘤細胞表面,經(jīng)胞吞作用將阿霉素攝入腫瘤細胞內,直接有效地起到抗腫瘤效果,并減少對正常細胞的損傷。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑和儀器

        人惡性黑色素瘤細胞系A375(以下簡稱為A375),人腎上皮細胞系293T(以下簡稱為293T),均購于中科院上海細胞所;胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);DMEM培養(yǎng)液、胰酶、PBS(江蘇凱基生物技術股份有限公司);外泌體提取試劑(美國Invitrogen公司);阿霉素(美國Sigma公司);熒光染劑DIO(美國Invitrogen公司)。

        電穿孔儀(美國Invitrogen公司);FACS Calibur型流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 細胞培養(yǎng)

        含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T細胞,待細胞融合至85%~90%時,傳代培養(yǎng),收集第6~8代293T細胞用于下一步實驗研究。

        1.2.2 質粒構建與細胞轉染

        293T細胞接種至六孔板,細胞85%~90%融合時,按Lipofectamine 2000說明書配置溶液A:240 μL無血清DMEM+10 μL Lipofectamine2000;溶液B:233 μL無血清DMEM+17 μL pcDNA3.1(+)-hLAMP2b-CysiRGD質粒。質粒序列:TGCTGTAGAGGTGACAAAGGCCCAGATTGTGGTGGATCATGC。將A、B在5 min內混勻,室溫放置20 min后,每孔各加入2 mL DMEM,A、B混勻后懸滴加入培養(yǎng)液中,標記為空白轉染組(對照組)、iRGD轉染組(實驗組)。搖動培養(yǎng)板輕輕混勻,放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換含10%胎牛血清的FBS培養(yǎng)液,24 h后收集上清,提取外泌體。

        1.2.3 外泌體的提取

        細胞轉染收集上清,2 000 g離心30 min,離心后收集1 mL上清,加入500 μL Total Exosome Isolation reagent,4℃過夜,10 000 g 4℃離心1 h,棄上清,分別獲得空白轉染-外泌體(blank-exo,對照組)、iRGD-外泌體(iRGD-exo,實驗組),沉淀,-20℃保存。

        1.2.4 藥物包裝

        將0.2 μL外泌體+50 μg阿霉素用buffer混勻(200 μL體系),常溫下1 KV、20 ms電穿孔后4℃保存,分別獲得空白轉染-外泌體-阿霉素(blankexo-dox,對照組)與iRGD-外泌體-阿霉素(iRGD-exo-dox,實驗組)。

        1.2.5iRGD的RT-PCR檢測

        取凍存外泌體抽提RNA,并將其轉合成為cDNA,進行PCR反應,GAPDH設為管家基因。PCR反應條件:94℃預變性5 min,94℃變性40 sec,40℃退火40 sec,72℃延伸1 min。將EP管放入儀器擴增,循環(huán)35次;72℃延伸10 min。4℃儲存。用1%瓊脂糖凝膠進行電泳,并檢測拍照。

        GAPDH引物序列:上游5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’,下游5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’;iRGD引物序列:上游TCGATGTTAGACCTGGAAATAGTGGTGCTGTG,下游CCGGCACAGCACCACTATTTCCAGGTCTAACA。

        1.2.6A375細胞染色

        用含10%胎牛血清的FBS培養(yǎng)液在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩組A375細胞,待細胞65%~70%左右融合時,使用試劑Dio進行細胞染色。使用DMSO配置成1 mM濃度作為儲存液,PBS稀釋200倍至5 μM工作液,將稀釋好的Dio染料懸滴加入A375細胞培養(yǎng)皿中,37℃、5%CO2孵育1 h。PBS溶液清洗染劑,在細胞培養(yǎng)皿中加入10 mL含10%胎牛血清的FBS培養(yǎng)液。

        1.2.7 外泌體結合

        將獲取的blank-exo-dox、iRGD-exo-dox懸液分別懸滴加入已Dio染色的A375細胞培養(yǎng)皿中,37℃、5%CO2孵育1 h后,PBS清洗3次,去除多余的外泌體,分別得到A組(blank-exo-dox-A375,實驗組)、B組(iRGD-exo-dox-A375,對照組)細胞,分別進行流式細胞儀檢測和細胞增殖檢測。

        1.2.8 流式細胞儀檢測

        胰酶消化后分別獲取A組和B組細胞懸液,1 000 g離心3 min,棄上清,獲取細胞沉淀,將兩組細胞沉淀分別加入0.9%NaCl,稀釋至1 mL,用于流式細胞儀檢測,并記錄數(shù)據(jù)。

        1.2.9 細胞增殖檢測

        取96孔板,分別用于檢測A、B組細胞,每孔加入100 μL的A或B細胞懸液(1×104個/孔)。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的條件培養(yǎng)箱中分別孵育0、24、48、72、96 h,向待測孔加入10 μL CCK-8溶液。每組細胞、每個時間點取3個樣品檢測,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育1~4 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

        2 結果

        2.1iRGD-外泌體的鑒定

        我們通過RT-PCR對iRGD mRNA的表達水平進行評估。結果顯示相較于blank-exo,iRGD-exo具有較高水平的iRGD mRNA表達(圖1)。

        圖1RT-PCR檢測iRGD的mRNA表達Fig.1The mRNA expression of iRGD detected by RT-PCR

        2.2iRGD-外泌體-阿霉素靶向于A375細胞的研究

        為了確認iRGD是否靶向于A375細胞上的αν整合肽,我們將blank-exo-dox、iRGD-exo-dox懸液分別懸滴加入已Dio染色的A375細胞培養(yǎng)皿中。流式細胞檢測證實,iRGD-exo-dox與A375細胞的結合效率高于blank-exo-dox(分別為41.5%、8.4%),表明iRGD可特異性結合于A375細胞表面的αν整合素(圖2)。

        圖2 流式細胞儀檢測結果Fig.2Results of flow cytometry

        2.3iRGD-外泌體抑制A375細胞的效果

        使用iRGD-exo-dox與blank-exo-dox對A375細胞進行24、48、72、96 h存活能力分析。CCK-8檢測顯示iRGD-exo-dox抑制了細胞的增殖,但在blank-exo-dox中并沒有觀察到明顯的抑制情況,表明iRGD-exo-dox對A375細胞的增殖有明顯的抑制作用(圖3)。

        圖3A375細胞增殖曲線Fig.3The curve of cell proliferation in A375 cells

        3 討論

        近年的研究認為,靶向治療可直接高效地起到抗腫瘤作用,但靶向治療的瓶頸在于發(fā)現(xiàn)的相關腫瘤的細胞表面特異性抗原有限。目前已發(fā)現(xiàn)的惡性黑色素瘤標志物有:黑色素瘤細胞分化抗原糖蛋白(Glycoprotein,gp)100、黏附分子L1-CAM、人內源性逆轉錄病毒K包膜蛋白(HERV-K)等[7]。這些標志物在多種實體瘤,如惡性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌中均有過度表達,而在正常細胞中表達量極低,它們的相對特異性表達是當前治療相關腫瘤的重要靶點[8-13]。Krishnamurthy等[7]利用HERV-K的腫瘤特異性,構建相關嵌合抗原受體修飾的T細胞(CAR-T),特異性識別HERV-K并與其結合,起到了限制腫瘤生長的效果。

        αν整合素是細胞表面的一種黏附分子,主要通過介導細胞與細胞外基質的黏附作用,而影響細胞的生物學行為,在正常細胞表面呈低表達水平,同樣在多種實體瘤細胞表面呈高表達水平,與腫瘤的侵襲、轉移密切相關[14]。乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、惡性黑色素瘤等腫瘤細胞表面均過度表達αν整合素,Tian等[3]利用αν整合素表達的相對特異性,聯(lián)合設計體內和體外實驗,將化療藥物靶向作用于乳腺癌細胞,取得顯著療效。本實驗針對惡性黑色素瘤細胞表面αν整合素的高水平表達,體外構建iRGD-exo-dox顆粒,將阿霉素特異性作用于惡性黑色素瘤細胞(A375細胞),觀察對惡性黑色素瘤體外增殖的影響。

        外泌體是由內皮細胞和造血干細胞產生的磷脂雙分子層囊泡,可經(jīng)胞吞作用被細胞攝取,是運輸化療藥物的理想載體[15]。與傳統(tǒng)化療方法相比,經(jīng)外泌體轉載的化療藥物可特異性作用于腫瘤細胞,其納米級(10~100 nm)結構可避免體內單核巨噬細胞的吞噬[6],可以提高抗腫瘤的效能;同時還能避免對正常細胞的損傷,降低化療的副作用。目前,大量的化療藥物因劑量依賴性副作用而導致應用受限。阿霉素是常見的臨床化療藥物,對腫瘤生長控制有顯著效果,但同時也可廣泛作用于全身正常細胞,而引起心血管系統(tǒng)損傷[16]。本研究在體外構建運載化療藥物(阿霉素)的載體,通過載體與細胞之間的靶向結合直接將藥物作用于腫瘤細胞,安全高效地遏制惡性黑色素瘤的增殖。我們在體外培養(yǎng)293T細胞,待細胞融合率達80%~90%時,體外轉染iRGD,提取外泌體,通過電穿孔包裹阿霉素,利用流式細胞儀檢測iRGD-外泌體-阿霉素對A375細胞的親和力,并對iRGD-外泌體-阿霉素抑制A375細胞的增殖能力進行分析。結果顯示,iRGD-外泌體-阿霉素與A375細胞的結合率高于空白轉染-外泌體-阿霉素,且iRGD-外泌體-阿霉素可明顯抑制A375細胞的增殖,而空白轉染-外泌體-阿霉素未觀察到明顯的抑制作用,說明表達iRGD蛋白的外泌體攜載阿霉素能更有效地抑制細胞增殖,起到抗腫瘤作用。

        近年來,惡性黑色素瘤的發(fā)病率逐漸增加,80%皮膚癌的死亡與惡性黑色素瘤相關。常隱匿起病,但進展速度快,早期易發(fā)生轉移,惡性度高,預后差,生存中位數(shù)只有6個月左右[17]。傳統(tǒng)的手術切除、放化療對惡性黑色素瘤的治療效果均不明顯,且截肢術及放化療的毒副作用增加了患者的痛苦。應用外泌體作為藥物載體的靶向治療在提高抗腫瘤效能的同時,也降低了患者放化療的痛苦。外泌體來源廣、免疫原性低,在靶向治療領域中具有廣闊的應用前景。相信隨著更為深入的研究,有望為包括惡性黑色素瘤在內的腫瘤治療,開辟一條高效可行的新途徑。

        [1]Egberts F,Bohne AS,Kruger S,et al.Varying mutational alterations in multiple primary melanomas[J].J Mol Diagn,2016,18(1):75-83.

        [2]Reichrath J,Reichrath S.Sunlight,vitamin D and malignant melanoma:an update[J].Adv Exp Med Biol,2014,810:390-405.

        [3]Tian Y,Li S,Song J,et al.A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy[J].Biomaterials,2014,35(7):2383-2390.

        [4]Alvarez-Erviti L,Seow Y,Yin H,et al.Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes[J].Nat Biotechnol,2011,29(4):341-345.

        [5]Jang SC,Kim OY,Yoon CM,et al.Bioinspired exosome-mimetic nano vesiclesfortargeteddeliveryofchemotherapeuticsto malignant tumors[J].ACS Nano,2013,7(9):7698-7710.

        [6]van den Boorn JG,Schlee M,Coch C,et al.SiRNA delivery with exosome nanoparticles[J].Nat Biotechnol,2011,29(4):325-326.

        [7]Krishnamurthy J,Rabinovich BA,Mi T,et al.Genetic engineering of T cells to target HERV-K,an ancient retrovirus on melanoma [J].Clin Cancer Res,2015,21(14):3241-3251.

        [8]Reiche J,Pauli G,Ellerbrok H.Differential expression of human endogenous retrovirus K transcripts in primary human melanocytes and melanoma cell lines after UV irradiation[J].Melanoma Res, 2010,20(5):435-440.

        [9]Wang-Johanning F,Liu J,Rycaj K,et al.Expression of multiple human endogenous retrovirus surface envelope proteins in ovarian cancer[J].Int J Cancer,2007,120(1):81-90.

        [10]Jones RB,Garrison KE,Mujib S,et al.HERV-K-specific T cells eliminate diverse HIV-1/2 and SIV primary isolates[J].J Clin Invest,2012,122(12):4473-4489.

        [11]Contreras-Galindo R,Kaplan MH,Leissner P,et al.Human endogenous retrovirus K(HML-2)elements in the plasma of people with lymphoma and breast cancer[J].J Virol,2008,82(19): 9329-9336.

        [12]Wang-Johanning F,Radvanyi L,Rycaj K,et al.Human endogenous retrovirus K triggers an antigen-specific immune response in breast cancer patients[J].Cancer Res,2008,68(14):5869-5877.

        [13]Schmitt K,Reichrath J,Roesch A,et al.Transcriptional profiling of human endogenous retrovirus group HERV-K(HML-2)loci in melanoma[J].Genome Biol Evol,2013,5(2):307-328.

        [14]Sugahara KN,Teesalu T,Karmali PP,et al.Tissue-penetrating delivery of compounds and nanoparticles into tumors[J].Cancer Cell,2009,16(6):510-520.

        [15]Tan L,Wu H,Liu Y,et al.Recent advances of exosomes in immune modulation and autoimmune diseases[J].Autoimmunity, 2016,49(6):357-365.

        [16]Li HQ,Wu YB,Yin CS,et al.Obestatin attenuated doxorubicininduced cardiomyopathy via enhancing long noncoding Mhrt RNA expression[J].Biomed Pharmacother,2016,81:474-481.

        [17]Mar VJ,Liu W,Devitt B,et al.The role of BRAF mutations in primary melanoma growth rate and survival[J].Br J Dermatol, 2015,173(1):76-82.

        The Inhibition of iRGD-Exosomes-Doxorubicin on the Proliferation of Malignant Melanoma in Vitro

        ObjectiveTo investigate the effect and targeting of iRGD-exosomes-doxorubicin(iRGD-exo-dox)on the inhibition of A375 cell line.MethodsThe exosomes were extracted from the iRGD-transfected A375 cells.The doxorubicin was wrapped by electroporation.Flow cytometry was used to detect the affinity of iRGD-exo-dox to A375 cells.The ability of iRGD-exo-dox on inhibiting the proliferation of A375 cells was analyzed.ResultsThe affinity of iRGD-exo-dox to A375 cells was higher than the blank-exo-dox.The proliferation of A375 cells was obviously inhibited by iRGD-exo-dox.The inhibition effect was not observed in blank-exo-dox group.ConclusioniRGD-exo-dox can inhibit the proliferation of A375 cells by targeting function.

        Malignant melanoma;Targeted therapy;Exosome;Doxorubicin

        R739.5

        B

        1673-0364(2017)01-0025-04

        ZHAO Lijuan,ZHENG Jianghong,LIU Xiangdong,MAO Guangyu,DENG Chenliang,YANG Songlin.
        Department of Plastic Surgery, Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233,China.Corresponding author:YANG Songlin(E-mail:slyang@sjtu.edu.cn).

        16日;

        2017年1月22日)

        10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.007

        200233上海市上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院整形外科。

        楊松林(E-mail:slyang@sjtu.edu.cn)。

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