林懷安 余力 王健 張波 鄭丹寧 周佳

丹參對3T3-L1細(xì)胞成脂分化與增殖的影響

林懷安 余力 王健 張波 鄭丹寧 周佳

目的觀察丹參對3T3-L1細(xì)胞成脂分化和增殖的影響，為丹參應(yīng)用于自體脂肪移植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法將含有不同終濃度丹參注射液的完全培養(yǎng)液（0.6 g/L、0.3 g/L、0.15 g/L、0.075 g/L、0.04 g/L、0.02 g/L）分別加入誘導(dǎo)分化的3T3-L1細(xì)胞，待細(xì)胞分化至成熟脂肪細(xì)胞時(shí)，利用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力；利用油紅O染色法、Image-pro plus 6.0軟件觀察脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的聚積；利用甘油三酯GPO-POD法測定脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)含量。結(jié)果丹參可促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞增殖，且呈一定的時(shí)間、劑量依賴關(guān)系：加藥時(shí)間點(diǎn)越早，對3T3-L1細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用越大；丹參濃度越大，對3T3-L1細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用越大。丹參同時(shí)也促進(jìn)了3T3-L1細(xì)胞的成脂分化，增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的聚積，并呈一定的劑量依賴關(guān)系。結(jié)論丹參能夠促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的成脂分化以及增殖，使成熟脂肪細(xì)胞的數(shù)量增加。

丹參3T3-L1細(xì)胞增殖細(xì)胞分化

自體脂肪移植用于軟組織的填充與修復(fù)重建，具有取材簡便、來源豐富、生物相容性良好、無排異反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。臨床上各種提高脂肪移植存活率的方法，其結(jié)果仍然不盡如人意[1]。

為提高自體脂肪移植的存活率，達(dá)到理想的填充結(jié)果，針對移植脂肪組織的存活機(jī)制進(jìn)行了大量研究，由脂肪來源干細(xì)胞（Adipose derived stromal/ stem cells，ADSC）主導(dǎo)的“脂肪細(xì)胞再生”理論，以及加快移植脂肪組織的血運(yùn)重建，是提高移植脂肪存活率的關(guān)鍵因素[2]。ADSC是脂肪組織特有的前體細(xì)胞，其抗缺血、缺氧能力強(qiáng)，能克服移植早期的缺血狀態(tài)，待血氧充足時(shí)，可分化為成熟的脂肪細(xì)胞，促進(jìn)脂肪組織的更新[3]。在脂肪移植術(shù)后，促進(jìn)低分化ADSC增殖，并向成熟的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，盡可能地保持脂肪移植組織的體積和重量，從而提高脂肪移植的存活率。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，丹參具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、防止心肌缺血和心肌梗死等作用，被廣泛用于心血管疾病的治療。研究證實(shí)，其活性成分不但可以直接保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，還可以通過增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量以促進(jìn)血管內(nèi)皮的修復(fù)[4]。同時(shí)，丹參可促進(jìn)多種細(xì)胞的分化增殖[5]。3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞株具有ADSC的生理、生化特性及細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)誘導(dǎo)可分化為成熟的脂肪細(xì)胞，被廣泛應(yīng)用于體外脂肪細(xì)胞分化的研究[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同濃度的丹參對3T3-L1細(xì)胞增殖與成脂分化的影響，探討丹參注射液對ADSC增殖與分化的作用，為進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材

小鼠3T3-L1細(xì)胞（ATCC細(xì)胞庫，美國）；丹參注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone公司，美國）；0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、地塞米松、合成人胰島素、青鏈霉素（Sigma公司，美國）；細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒（同仁化學(xué)研究所，日本）；油紅O染液、甘油和甘油三酯測試盒（南京建成生物工程研究所）。

超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（FormaScientific公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；100 mm培養(yǎng)皿、離心管（FALCON公司，美國）；Image Pro Plus 6.0軟件（Media Cybernetics公司，美國）；酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)與分化

將3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基（高糖DMEM，含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素），于37℃、5%CO2下培養(yǎng)。細(xì)胞生長融合至80%時(shí)，以0.25%胰酶消化，1∶4傳代。取第5代細(xì)胞用于成脂分化，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104cells/L，接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合48 h后，將培養(yǎng)基更換為含有誘導(dǎo)液A（0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L DEX，10 μg/mL INS）的完全培養(yǎng)基（為誘導(dǎo)分化的第0天）。48 h后，換成含有誘導(dǎo)液B（高糖DMEM，含10 μg/mL INS）的完全培養(yǎng)基（為誘導(dǎo)分化的第2天）。48 h后，再換回不含誘導(dǎo)液的完全培養(yǎng)基，隔2天換液一次。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞增殖活力分析

將3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104cells/L，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。在誘導(dǎo)分化至第4天、第6天、第8天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有不同終濃度（0.6 g/L、0.3 g/L、0.15 g/L、0.075 g/L、0.04 g/L、0.02 g/L）丹參注射液的完全培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)。對照組加入不含丹參的完全培養(yǎng)液。隔2天換液一次，各組均設(shè)6個復(fù)孔。在誘導(dǎo)分化的第9天、第10天、第11天于每孔加入含有10%CCK-8溶液的PBS溶液100 μL，37℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值。

本文通過對研究區(qū)域生態(tài)重建現(xiàn)場調(diào)查，獲取研究區(qū)原始資料和數(shù)據(jù)，通過分析植物群落特征，結(jié)合現(xiàn)場植被樣方調(diào)查數(shù)據(jù)，選取合適的評價(jià)指標(biāo)因子，建立一套合理的評價(jià)體系，對研究區(qū)生態(tài)重建效果進(jìn)行定量評價(jià)，從而為礦山生態(tài)重建下一步規(guī)劃設(shè)計(jì)提供科學(xué)依據(jù)。

1.2.3 油紅O染色

將3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104cells/L，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL。第4天，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有不同終濃度丹參注射液的完全培養(yǎng)液，對照組加入不含丹參的完全培養(yǎng)液。第9天時(shí)，PBS溶液沖洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗細(xì)胞3次，油紅O室溫染色15 min，PBS沖洗多余油紅O染液3次，鏡下觀察并拍照，以Image-pro plus 6.0軟件分析油紅O染色陽性面積。

1.2.4 甘油三酯含量測定

將3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104cells/L，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔500 μL。第4天，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有不同終濃度丹參注射液的完全培養(yǎng)液，對照組加入不含丹參的完全培養(yǎng)液。第9天時(shí)，每孔加入100 μL含有PMSF終濃度為1 mM的TritionX-100裂解液，裂解30 min。按照甘油三酯測試盒說明書，將裂解好的細(xì)胞樣本、甘油校準(zhǔn)品、蒸餾水各2.5 μL分別加入至96孔板，并設(shè)立對照組，各組均設(shè)6個復(fù)孔，每孔再加入工作液250 μL，混勻后于37℃下孵育10 min，用酶標(biāo)儀測定510 nm處的吸光度值。同時(shí)用BCA蛋白含量試劑盒測定細(xì)胞樣本的總蛋白濃度，以甘油標(biāo)準(zhǔn)液作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測出蛋白濃度以校正TG值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以（x±s）表示，兩組間差異采用t檢驗(yàn)，兩組以上組間差異采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參對分化不同時(shí)期的3T3-L1細(xì)胞增殖活力的影響

第4天丹參終濃度為0.6 g/L和0.3 g/L的實(shí)驗(yàn)組，與對照組的差異顯著（P＜0.05）；其他濃度的實(shí)驗(yàn)組與對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

第6天和第8天，實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1-A）。

第4天丹參終濃度為0.02 g/L的實(shí)驗(yàn)組與對照組無明顯差異（P＞0.05），其余各濃度實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

第6天丹參終濃度為0.04 g/L、0.02 g/L的實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各濃度實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異明顯（P＜0.05）。

第8天丹參終濃度為0.6 g/L、0.3 g/L的實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異顯著（P＜0.05），其余各濃度實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異無顯著性（P＞0.05）（圖1-B）。

第10天測量吸光度值發(fā)現(xiàn)，第4天、第6天、第8天加入丹參的實(shí)驗(yàn)組和對照組的吸光度值均達(dá)到高峰。第4天加入丹參的實(shí)驗(yàn)組相比第6天、第8天加入丹參的實(shí)驗(yàn)組，以及與對照組之間的差異顯著（P＜0.05）；第6天加入丹參的實(shí)驗(yàn)組與第8天加入丹參的實(shí)驗(yàn)組，以及與對照組之間均存在顯著性差異（P＜0.05）（圖1-D、圖1-E、圖1-F）。

第11天測量吸光度值發(fā)現(xiàn)，第4天、第6天加入丹參的實(shí)驗(yàn)組與對照組存在顯著差異（P＜0.05）。第8天加入丹參終濃度為0.02 g/L的實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1-C），其余各濃度均與對照組存在顯著性差異（P＜0.05）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹參濃度越大，對3T3-L1細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用越大；丹參作用時(shí)間越長，其對3T3-L1細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用越大。

2.2 丹參對3T3-L1細(xì)胞脂質(zhì)聚積的影響

油紅O染色顯示，終濃度0.6 g/L的實(shí)驗(yàn)組與其他濃度實(shí)驗(yàn)組相比，脂滴聚積更多、脂滴更大；對照組與實(shí)驗(yàn)組相比差異明顯（圖2）。

油紅O染色陽性面積結(jié)果顯示，丹參終濃度為0.02 g/L的實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其他個濃度實(shí)驗(yàn)組與對照組均存在明顯差異，且呈劑量依賴關(guān)系（圖3）。

2.3 丹參對3T3-L1細(xì)胞甘油三酯含量的影響

甘油三酯含量測定顯示，實(shí)驗(yàn)組與對照組存在顯著性差異，并呈劑量依賴關(guān)系（圖4）。

圖1 不同分化時(shí)間各組的細(xì)胞增殖活力Fig.1Cell viability in each group at different incubation time

圖2 油紅O染色觀察丹參對脂質(zhì)聚積的影響（100×）Fig.2Photographs of S.miltiorrhiza-treated differentiated adipocytes stained by Oil Red O(100×)

圖3 油紅O染色陽性面積比較Fig.3The comparison of the positive area by Oil Red O staining

3 討論

自體脂肪組織作為軟組織填充物，具有取材簡便、來源豐富、供區(qū)損傷小、填充外觀好、組織相容性好等優(yōu)勢。但是，較高的吸收率導(dǎo)致了治療效果存在不確定性。近年來，眾多研究都聚焦于提高自體脂肪組織移植的存活率，特別是自體移植脂肪的成活機(jī)制等方面。

近年來，有研究探索了中藥促進(jìn)自體脂肪移植存活率的研究，如川穹嗪、黃芪等，獲得了能夠提高自體脂肪存活率的肯定結(jié)果[7]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，丹參具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、防止心肌缺血和心肌梗死等作用，被廣泛用于心血管疾病的治療。經(jīng)研究證實(shí)，其活性成分不但可以直接保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，還可以通過增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量，以促進(jìn)內(nèi)皮的修復(fù)[4]。大量研究表明，丹參可促進(jìn)多種細(xì)胞的分化增殖[5]。我們探討丹參對前脂肪細(xì)胞的分化和增殖的影響，探尋能促進(jìn)ADSC分化增殖的方法，提高移植脂肪細(xì)胞的存活率。

常規(guī)的成脂誘導(dǎo)中，在加入誘導(dǎo)液后的第8～12天即可分化為成熟的脂肪細(xì)胞，即進(jìn)入終末分化期，成熟脂肪細(xì)胞基本沒有增殖的能力。3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，首先讓前脂肪細(xì)胞增殖，當(dāng)細(xì)胞匯合后進(jìn)入接觸抑制階段，此時(shí)細(xì)胞停止分裂增殖；然后在誘導(dǎo)液的刺激下，前脂肪細(xì)胞進(jìn)入特定的細(xì)胞分裂期開始克隆擴(kuò)增；最后進(jìn)入終末分化期，分化為成熟的脂肪細(xì)胞，克隆增殖終止[8]。本研究中，我們利用CCK-8法檢測3T3-L1細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞時(shí)的增殖活力，即檢測終末分化期的細(xì)胞增殖活力。結(jié)果顯示，在終末分化期，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞仍存在增殖活力，丹參對3T3-L1細(xì)胞增殖活力的具有明顯的促進(jìn)作用。盧慧玲等[9]證實(shí)，3T3-L1細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞時(shí)，部分含有大量脂滴的成熟脂肪細(xì)胞仍具有雙核，處于細(xì)胞分裂期，尚存在分裂增殖的能力。

圖4 各組甘油三酯含量Fig.4TG content in each group

我們在誘導(dǎo)后的不同時(shí)間點(diǎn)（第4天、第6天、第8天）加入丹參。結(jié)果表明，丹參作用時(shí)間越長，其對3T3-L1細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用越大。在3T3-L1細(xì)胞分化的不同時(shí)期中，丹參不僅對前脂肪細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，即使在第8天，即終末分化期，仍然能促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞的增殖。甘油三酯含量測定和油紅O染色也證實(shí)了這一點(diǎn)。同時(shí)，丹參在促進(jìn)細(xì)胞分化增殖方面具有劑量依賴性，丹參濃度越大，對3T3-L1細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用越大。

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Effect of Salvia Miltiorrhiza on Proliferation and Differentiation of 3T3-L1 Cells

ObjectiveTo explore the effect of Salvia miltiorrhiza on proliferation and differentiation of 3T3-L1 cells,so as to provide evidence for further research and clinical application of fat transplantation.MethodsThe differentiating 3T3-L1 cells after adipogenic induction were incubated with different concentration of S.miltiorrhiza(0.6 g/L,0.3 g/L,0.15 g/L,0.075 g/L, 0.04 g/L,0.02 g/L).After the 3T3-L1 cells differentiated into mature adipocyte,the cell proliferation viability was determined by CCK-8 assay kit.The lipid droplets accumulation of adipocyte were observed by Oil Red O staining and Image Pro Plus 6.0.The adipogenesis was quantified by measuring lipid content using triglyceride GPO-POD assay kit.ResultsS. miltiorrhiza promoted a dose-and time-dependent increase in 3T3-L1 cell proliferation viability.The earlier the dosing time was,the better the cell proliferation viability would be;The higher the concentration was,the better the cell proliferation viability would be.Within the six S.miltiorrhiza concentrations confine,S.miltiorrhiza also promoted a dose-dependent increase in 3T3-L1 cell differentiation ability,enhanced the lipid droplets accumulation of 3T3-L1 adipocyte.Conclusion S.miltiorrhiza can promote the increase of adipocyte number via the proliferation and differentiation of 3T3-L1 cells.

Salvia miltiorrhiza;3T3-L1;Cell proliferation;Cell differentiation

R622+.9

A

1673－0364（2017）01－0017－04

LIN Huaian,YU Li,WANG Jian, ZHANG Bo,ZHENG Danning,ZHOU Jia.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:YU Li(E-mail: youli@sh163.net)

2016年11月4日；

2016年12月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.005

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

余力（E-mail：youli@sh163.net）。