鄭亞麗，顧麗莉**，張夢曉，孔光輝，彭 健，楊萬明

(1.昆明理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪 653100)

我國是農(nóng)業(yè)大國，為了保證農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，做好病蟲害的防治工作，農(nóng)藥的使用必不可少[1]。但農(nóng)藥殘留問題嚴(yán)重影響人的身體健康，破壞生態(tài)平衡。所以，農(nóng)藥殘留檢測方法和技術(shù)越來越受到人們的關(guān)注。

近年來，隨著人們對生態(tài)環(huán)境要求的提高和分析技術(shù)的不斷發(fā)展,國內(nèi)外相關(guān)部門均降低了農(nóng)殘的最大殘留檢測限，提出了更高的前處理要求，這就需要更快捷精準(zhǔn)的檢測技術(shù)。所以，研究快速、靈敏、選擇性高的預(yù)處理方法具有重要的意義[2]。分子印跡是一項具備特異識別功能的新興技術(shù)，具有成本低、易于合成、穩(wěn)定性高、理化性質(zhì)穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)點。該技術(shù)已在農(nóng)藥痕量殘留分析等多個領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景[3-6]。

1 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)(Molecular Imprinting Technology,MIT)以德國G Wuff[7]研究組1972年合成的分子印跡聚合物(Molecular Imprinted Polymers,MIPs)開始引起關(guān)注的。

1.1 MIPs的制備原理

MIPs的制備一般包括三個過程。首先，選擇合適的功能單體，使功能單體與模板分子以共價或非共價作用結(jié)合；其次，加入交聯(lián)劑，在引發(fā)劑的作用下引發(fā)單體進(jìn)行光聚合或熱聚合，使模板分子與功能單體固定在聚合物基質(zhì)中；最后，用化學(xué)斷裂或溶劑萃取法除去模板分子，在聚合物的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中留下一個與模板分子在尺寸、形狀和結(jié)構(gòu)方面相匹配的三維孔穴，見圖1。

圖1 分子印跡聚合物制備示意圖

因為MIPs是根據(jù)模板分子“量身定做”的，因此MIPs對模板分子及其結(jié)構(gòu)相似物具有較高的特異性識別能力[8]。即所得到的MIPs具有預(yù)定性、實用性和專一性等特點。其優(yōu)點主要有：可重復(fù)性，成本低，易制備，物理化學(xué)穩(wěn)定性高等，因而這種技術(shù)越來越受到人們的關(guān)注[9]。

1.2 結(jié)合方式及特點

共價鍵法、非共價鍵法和半共價鍵法是單體和印跡分子的三種主要結(jié)合方式。

共價鍵法最先是由Wulff[10]等人提出來的。在形成聚合物之前，由模板分子和功能單體形成可逆的共價鍵。然后，再把模板分子從相應(yīng)的共價鍵處移去，以便重新結(jié)合被分析物。模板分子和功能單體之間的高度穩(wěn)定性形成了相對均一的結(jié)合位點，減少了非特異性識別位點的存在。但模板和功能單體在溫和條件下結(jié)合和斷裂比較困難，導(dǎo)致模板分子難以反復(fù)利用。非共價鍵法由Arshady和Mosbach[11]提出。模板分子和功能單體之間是靠較弱的非共價相互作用力(如氫鍵、靜電引力、電荷轉(zhuǎn)移、范德華力等)形成的。因其步驟簡單并且模板分子和許多功能單體都可以相互作用，所以它的應(yīng)用最廣。其缺點是，為了使該過程的平衡有利于向單體-模板復(fù)合物生成的方向移動并保持穩(wěn)定，一般需要使用大量的功能單體，因此常會出現(xiàn)非特異性結(jié)合位點，導(dǎo)致MIPs的宏觀特異吸附性能降低。半共價鍵法是由Whitcombe等[12]提出的，首先模板與功能單體以共價鍵結(jié)合，重新進(jìn)行分子識別時是依據(jù)非共價作用方式。Taguchi等[13]以半共價印跡法合成了細(xì)胞色素-C分子印跡聚合物，相比非公價鍵法，該方法所制備的聚合物選擇性更高。

1.3 制備方法

目前已報道的分子印跡聚合物的制備方法有很多，常見的主要有本體聚合，沉淀聚合，懸浮聚合和原位聚合等。

1.3.1 本體聚合法

本體聚合(Bulk polymerization)是將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑按照一定的比例在惰性氣體(如氮氣)氛圍中，于真空環(huán)境下進(jìn)行熱引發(fā)或者光引發(fā)形成塊狀模板聚合物。經(jīng)粉碎、研磨、過篩后，將該聚合物微粒洗脫除去模板分子，低溫干燥后即形成具有特定空間結(jié)構(gòu)的MIPs。作者在Mohammad[14]等人制備方法的基礎(chǔ)上對致孔劑的量進(jìn)行了優(yōu)化，使得所制備的聚合物疏松多孔且剛硬度適合。實驗證明，該方法制備過程簡單，條件易控，所得產(chǎn)物純度高，但制備過程冗長，且MIPs產(chǎn)量低。

1.3.2 沉淀聚合法

Zhang[15]等以1，3正丁基苯酞(I-NBP)作為模板分子，丙烯酰胺作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑，丙酮作為溶劑，通過沉淀聚合法(Precipitation polymerization)合成分子印跡聚合物。一系列吸附實驗證明，該聚合物具有很好的吸附性能并且對目標(biāo)分子I-NBP具有很高的選擇性。Miura等[16]通過改進(jìn)的沉淀聚合法得到識別性能良好的綠原酸分子印跡聚合物。之后，Miura等[17]又以4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酰胺作為功能單體，二乙烯基苯作為交聯(lián)劑，V(乙腈)∶V(甲苯)=3∶1，作為致孔劑，通過沉淀聚合法合成咖啡酸(CA)分子印跡聚合物，該MIPs對CA表現(xiàn)出了很高的選擇性。Pardeshi等[18]用沉淀聚合法合成了沒食子酸(GA)分子印跡聚合物，通過對比不同致孔劑下的掃描電子顯微鏡圖，指出不同致孔劑在顆粒尺寸和分子識別性能上的影響，從而選擇出最佳致孔劑。該方法制備的分子印跡聚合物能夠有效地從余甘果中萃取GA，且回收率很高。

1.3.3 懸浮聚合法

Mayes等[19]提出的懸浮聚合法(Suspension Polymerization)是制備球形MIPs的一種常用方法，其反應(yīng)體系是由單體、引發(fā)劑、分散劑和水組成的。選擇全氟烴作為分散介質(zhì)，因為其與一般有機(jī)溶劑都不互溶，故加入特制的聚合物表面活性劑，通過高速攪拌獲得乳濁液，加入引發(fā)劑，聚合后得到了粒度范圍分布窄、形態(tài)規(guī)則的MIPs微球。Sun等[20]用懸浮聚合法制備了分子印跡聚合物并做成分子印跡固相萃取(MISPE)柱來萃取人類血清和魚組織中的局部麻醉劑苯佐卡因(BZC),結(jié)果證明，BZC可以有效地被富集，其回收率達(dá)到90%。

1.3.4 原位聚合法

原位聚合(Situ polymerization)是將預(yù)聚合液直接涂在分析過程所用的不銹鋼柱子或者填充有印跡聚合物的柱子內(nèi)，從而無需再對印跡聚合物進(jìn)行裝柱，簡化了制備過程。Bai等[6]以原位聚合法合成了ART分子印跡膜，負(fù)載在石墨烯表面用于修飾玻碳電極，結(jié)果表明，該聚合物所制備的傳感器不僅靈敏度和選擇性高，而且再現(xiàn)性和重復(fù)性也好。

1.3.5 表面印跡法

表面印跡聚合(Surface-imprinting polymerization)是在基質(zhì)材料表面建立的一種分子識別體系的方法，該方法是將具有識別位點的印跡聚合層接枝或包裹在載體的表面，所獲得的MIPs具有溶脹系數(shù)小、傳質(zhì)速度快等特點，避免了模板分子包埋過深或過緊而無法完全洗脫的問題。其結(jié)合位點不易被破壞，選擇性更高[21]。Luo等[22]以撲熱息痛(PR)為模板分子，氧化石墨烯為載體制備了一種氧化石墨烯表面分子印跡溶膠凝膠聚合物，并用于電化學(xué)傳感器以快速檢測PR，結(jié)果證明該傳感器具有檢測迅速、選擇性高、檢測范圍寬、檢出限低等優(yōu)點，從而為藥物和臨床領(lǐng)域提供了廣闊的前景。

2 分子印跡技術(shù)在不同種類農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用

分子印跡技術(shù)作為一種前處理手段，具有較高的選擇性和較強的親和力，能夠從復(fù)雜基質(zhì)中特異性識別和捕捉目標(biāo)化合物，可使待測樣品中的痕量農(nóng)殘通過分子印跡聚合物吸附得到富集，為后續(xù)分析檢測提供了很大的便利。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用到磺酰脲類、三嗪類、有機(jī)磷類以及其它種類農(nóng)藥的檢測中，并取得了很好的效果。

2.1 磺酰脲類

磺酰脲類除草劑是目前應(yīng)用最廣泛的除草劑之一，因其具有較高的除草活性以及對哺乳動物具有較低的毒性，所以廣泛用于多種植物中。Tang等[23]以吡嘧磺隆(PS)為模板分子，通過MISPE柱來提純和富集水稻樣品中的PS、芐嘧磺隆(BSM)、苯磺隆(TBM)、甲磺隆(MSM)和煙嘧磺隆(NS)。PS的回收率可達(dá)95.6%，TBM的回收率為48.2%。Li等[24]以噻吩磺隆為模板分子做成的核殼型印跡電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測噻吩磺隆，結(jié)果表明，印跡傳感器的電化學(xué)發(fā)光強度是非印跡傳感器的2.7倍。Yang等[25]制備了親水外層雙功能吡嘧磺隆印跡聚合物，用于分析土壤中三種磺酰脲類除草劑的殘留量，加標(biāo)回收率為81%～99%，檢測限小于4.8%。證明了該聚合物可用于土壤中吡嘧磺隆的有效萃取。Fu等[26]以氯磺隆(CS)為模板分子制備了CS-MISPE用于水、土壤和小麥中殘留CS檢測，效果良好。

2.2 三嗪類

三嗪類除草劑是一種農(nóng)田雜草生長抑制劑，可對土壤、地下水等造成污染，對人類及動物不利，必須合理使用。Andrade等[27]以阿特拉津為模板分子，制備了分子印跡固相萃取小柱用于檢測玉米樣品中的三嗪類農(nóng)殘，三嗪類檢測限為1.6～3.3 μg/kg，回收率為80.2%～119.1%。Zhao等[28]以撲草凈為模板分子制備了單孔中空分子印跡聚合物微球(h-MIMs)，該聚合物比沉淀聚合和表面聚合具有更大的比表面積和更高的結(jié)合能力，用來檢測谷物中的三嗪類農(nóng)殘，其加標(biāo)回收率的范圍為(81±4)%～(96±4)%，表明該方法在食品監(jiān)管檢測中具有很大的潛力。Jesús等[29]以商用分子印跡小柱對環(huán)境中三嗪類及其代謝物進(jìn)行前處理，在SRM模式中通過用LC-MS/MS進(jìn)行分析，地下水中的檢測限低至0.015 ng/L，土壤和泥土中為0.2 ng/kg。該方法得到的回收率為55%～123%,日內(nèi)和日間RSD值分別為2%～4%和6%～10%。說明該分子印跡小柱對復(fù)雜基質(zhì)中三嗪類及其代謝物的前處理是非常有效的。

2.3 有機(jī)磷類

有機(jī)磷類是農(nóng)藥中極為重要的一種化合物，可用于防治植物病蟲害，不少種類有機(jī)磷農(nóng)藥毒性較強，在人和動物體內(nèi)積累可能會抑制血液和組織中乙酰膽堿酯酶的活性，進(jìn)而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒。Sun等[30]在甲基對硫磷印跡傳感器的選擇性實驗中，將硒化鎘二氧化硅納米球分子印跡聚合物及相應(yīng)的非分子印跡聚合物對四種有機(jī)磷農(nóng)藥的熒光熄滅量進(jìn)行檢測，得出甲基對硫磷的熒光熄滅量比率最高,熒光熄滅量的比率越高，表明硒化鎘二氧化硅納米球MIPs比NIPs材料具有更高的選擇性。Wu等[31]將TiO2納米顆粒作為催化劑用于魯米諾流動注射電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(CL)來檢測毒死蜱(CPF)，其線性范圍為1.0×10-10～5.0×10-7mol/L，檢測限為1.0×10-11mol/L(3δ)。CPF的流動注射電化學(xué)發(fā)光強度是三唑磷(TAP)的10倍，說明選擇性很高。

2.4 其它

Huang等[32]自制了一種新的MISPE柱來分離富集飼料中的三聚氰胺，加標(biāo)回收率達(dá)到95%，與NIP-SPE相比，MIP-SPE的萃取效率更高。Qu等[33]以撲草胺為模板分子制備成MISPE柱，對水、土壤及水稻樣品中的撲草胺進(jìn)行檢測，其加標(biāo)回收率分別為84.4%～87.4%，86.9%～97.1%,82.5%～94.2%，檢測限分別為3.39%～6.06%，3.52%～5.82%，1.58%～6.34%。Zhao等[34]以草甘膦為模板分子制備成分子印跡化學(xué)發(fā)光傳感器，在有干擾基質(zhì)存在的條件下對草甘膦進(jìn)行選擇性實驗，結(jié)果表明該分子印跡傳感器對草甘膦具有很高的選擇性。Hu等[35]以三唑酮為印跡分子，用SBSE-HPLC法對土壤中的三唑酮及其結(jié)構(gòu)相似物進(jìn)行萃取分析，得出檢測限為(0.14～0.34)mg/L，加標(biāo)回收率為86.7%～114.6%，該方法可用于土壤或其它復(fù)雜基質(zhì)中三唑類的檢測。

3 結(jié)束語

隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，食品安全及環(huán)境保護(hù)問題越來越被人們重視，而農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點。由于農(nóng)殘具有殘留量低、復(fù)雜基質(zhì)干擾嚴(yán)重等特點，所以，發(fā)展簡便、快速、重復(fù)性好的樣品前處理技術(shù)越來越關(guān)鍵。而分子印跡技術(shù)作為一種新型的分離技術(shù)，在痕量農(nóng)殘的分離、富集中取得了很大的進(jìn)步。盡管分子印跡技術(shù)在復(fù)雜體系的分離中顯示了其優(yōu)越性，但仍存在以下不足需要完善。首先，分子印跡技術(shù)的作用機(jī)理研究相對膚淺。目前研究的重心在分子印跡模板制備及其應(yīng)用，分子識別機(jī)理和結(jié)合位點的作用機(jī)理等關(guān)鍵研究不足。其次，分子印跡聚合物大多只能在有機(jī)相中進(jìn)行聚合和應(yīng)用，在水溶液或極性溶劑中的應(yīng)用需要深入研究和擴(kuò)展。最后，功能單體的可選擇范圍，交聯(lián)劑的種類和聚合方法都有較大的局限性，對于不含酸性或堿性基團(tuán)的印跡分子的提取應(yīng)用有待于更多的嘗試。

[1] 程立勛. 果蔬農(nóng)殘檢測方法的研究[J].中國農(nóng)業(yè)信息,2014,17:109.

[2] YU F,CHEN L,PAN L N,et al.Determination of multi-pesticide residue in tobacco using multi-walled carbon nanotubes as a reversed-dispersive solid-phase extraction sorbent[J].Journal of Separation Science,2015,38:1894-1899.

[3] HU X L,WU X,YANG F F,et al.Novel surface dummy molecularly imprinted silica as sorbent for solid-phase extraction of bisphenol A from water samples[J].Talanta,2016,148:29-36.

[4] YOLA M L,EREN T,ATAR N.A sensitive molecular imprinted electrochemical sensor based on gold nanoparticles decorated graphene oxide：application to selective determination of tyrosine in milk[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2015,210:149-157.

[5] LI X J,WANG X J,LI L L,et al.Electrochemical sensor based on magnetic graphene oxide@ gold nanoparticles-molecular imprinted polymers for determination of dibutyl phthalate[J].Talanta,2015,131:354-360.

[6] BAI H P,WANG C Q,CHEN J,et al.A novel sensitive electrochemical sensor based on in-situ polymerized molecularly imprinted membranes at graphene modified electrode for artemisinin determination[J].Biosensors and Bioelectronics,2015,64:352-358.

[7] WULFF G,SARHAN A.The use of polymers with enzyme-analogous structures for the resolution of racemates[J].Angewandte Chemie International Edition in English,1972,11(4):341-344.

[8] KRYSCIO D R,PEPPAS N A.Critical review and perspective of macromolecularly imprinted polymers[J].Acta Biomaterialia,2012,8(2):461-473.

[9] YI L X,FANG R,CHEN G H.Molecularly imprinted solid-phase extraction in the analysis of agrochemicals[J].Journal of Chromatographic Science,2013,51(7):608-618.

[10] WUFF G,SARHAN A.The use of polymers with enzyme-analogous structures for the resolution of racemate[J].Journal of the Angewandte Chemie International Edition,1972,11(3):341-345.

[11] ARSHADY R,MOSBACH K.Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization[J].Die Makromolekulare Chemie,1981,182(2):687-692.

[12] WHITCOMBE M J,RODRIGUEZ M E,VILLAR P,et al.A new method for the introduction of recognition site functionality into polymers prepared by molecular imprinting：synthesis and characterization of polymeric receptors for cholesterol[J].Journal of the American Chemical Society,1995,117(27):7105-7111.

[13] TAGUCHI H,SUNAYAMA H,TAKANO E,et al.Preparation of molecularly imprinted polymers for the recognition of proteins via the generation of peptide-fragment binding sites by semi-covalent imprinting and enzymatic digestion[J].Analyst,2015,140(5):1448-1452.

[14] GHOLIVAND M B,MALEKZADEH G.Computational design and synthesis of a high selective molecularly imprinted polymer for voltammetric sensing of propazine in food samples[J].Talanta,2012,89:513-520.

[15] ZHANG W,TAN N,JIA X H,et al.Synthesis,recognition characteristics and properties of l-3-n-butylphthalide molecularly imprinted polymers as sorbent for solid-phase extraction through precipitation polymerization[J].Materials Science and Engineering:C,2015,53:166-174.

[16] MIURA C,LI H,MATSUNAGA H,et al.Molecularly imprinted polymer for chlorogenic acid by modified precipitation polymerization and its application to extraction of chlorogenic acid from Eucommia ulmodies leaves[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2015,114:139-144.

[17] MIURA C,MATSUNAGA H,HAGINAKA J.Molecularly imprinted polymer for caffeic acid by precipitation polymerization and its application to extraction of caffeic acid and chlorogenic acid from Eucommia ulmodies leaves[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2016,127：32-38.

[18] PARDESHI S,DHODAPKAR R,KUMAR A.Molecularly imprinted microspheres and nanoparticles prepared using precipitation polymerisation method for selective extraction of gallic acid from Emblica officinalis[J].Food Chemistry,2014,146:385-393.

[19] MAYES A G,MOSBACH K.Molecularly imprinted polymer beads:suspension polymerization using a liquid perfluoroarbon as the dispersing phase[J].Analytical Chemistry,1996,68(21):3769-3774.

[20] SUN H,LAI J P,CHEN F,et al.Molecularly imprinted microspheres synthesized by a simple,fast,and universal suspension polymerization for selective extraction of the topical anesthetic benzocaine in human serum and fish tissues[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2015,407(6):1745-1752.

[21] ZHU G F,FAN J,GAO Y B,et al.Synthesis of surface molecularly imprinted polymer and the selective solid phase extraction of imidazole from its structural analogs[J].Talanta,2011,84(4):1124-1132.

[22] LUO J,CONG J J,FANG R X,et al.One-pot synthesis of a graphene oxide coated with an imprinted sol-gel for use in electrochemical sensing of paracetamol[J].Microchimica Acta,2014,181(11/12):1257-1266.

[23] TANG K J,GUX H,LUO Q S,et al.Preparation of molecularly imprinted polymer for use as SPE adsorbent for the simultaneous determination of five sulphonylurea herbicides by HPLC[J].Food Chemistry,2014,150:106-112.

[24] LI H F,XIEC G,FUX C.Electrochemiluminescence sensor for sulfonylurea herbicide with molecular imprinting core-shell nanoparticles/chitosan composite film modified glassy carbon electrode[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2013,181:858-866.

[25] YANG M X,ZHANGY Y,LIN S,et al.Preparationofabifunctionalpyrazosulfuron-ethylimprintedpolymer with hydrophilic external layers by reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization and its application in the sulfonylurea residue analysis[J].Talanta,2013,114:143-151.

[26] FU X W,WU Y J,QU J R,et al.Preparation and utilization of molecularly imprinted polymer for chlorsulfuron extraction from water,soil,and wheat plant[J].Environmental Monitoring and Assessment,2012,184(7):4161-4170.

[27] ANDRADE F N,NAZARIO C E D,SANTOS-NETOJ,et al.Development of on-line molecularly imprinted solid phase extraction-liquid chromatography-mass spectrometry for triazine analysis in corn samples[J].Analytical Methods,2016，8(5)：1181-1186.

[28] ZHAO Q,LI H,XU Y,et al.Determination triazine pesticides in cereal samples based on single-hole hollow molecularly imprinted microspheres[J].Journal of Chromatography A,2015,1376:26-34.

[30] SUN Q,YAO Q Q,SUN Z L,et al.Determination of parathion-methyl in vegetable by fluorescent-labeled molecular imprinted polymer[J].Chinese Journal of Chemistry,2011,29(10):2134-2140.

[31] WU J,FU X C,XIEC G,et al.TiO2nanoparticles-enhanced luminol chemiluminescence and its analytical applications in organophosphate pesticide imprinting[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2011,160(1):511-516.

[32] HUANG H B,ZHUANG Z X,ZHOUY L,et al.Separation and enrichment of melamine in feed by a new molecularly imprinted solid-phase extraction column[J].Animal Husbandry and Feed Science,2014,6(1):10-13.

[33] QU J R,ZHANG J J,GAO Y F,et al.Synthesis and utilisation of molecular imprinting polymer for clean-up of propachlor in food and environmental media[J].Food Chemistry,2012,135(3):1148-1156.

[34] ZHAO P N,YAN M,ZHANGC C,et al.Determination of glyphosate in foodstuff by one novel chemiluminescence-molecular imprinting sensor[J].Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2011,78(5):1482-1486.

[35] HU Y L,LI J W,LI G K.Synthesis and application of a novelmolecularly imprinted polymer-coated stirbar for microextraction of triazole fungicides in soil[J].J Sep Sci,2011,34(10):1190-1197.