閆 平，張 彥，張 寒，申旭霽，張明慧

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

錦燈籠是茄科植物酸漿干燥宿萼或帶果實的宿萼。宿萼味苦，氣微，果實味甘，性寒，微酸，具有清熱解毒、利咽化痰、利尿等作用；外治天皰瘡、濕疹。錦燈籠主要化學(xué)成分含有甾體類、生物堿類、黃酮類、多糖、豐富的礦物元素和維生素以及多種氨基酸[1-2]。

有研究表明多糖都具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗腫瘤等諸多功效[3-4],植物多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類多樣，且常與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等結(jié)合成多糖復(fù)合物，給多糖的提取分離帶來一定困難，加之多糖的提取方法和工藝尚未成熟以及效率、成本等多方面的考慮，所以選擇一種合適的提取分離方法對多糖的研究具有重大意義[5]。植物多糖憑借其獨特的生物活性、相對穩(wěn)定性、耐熱冷性和水溶性等，在保健品、功能飲料、冰淇淋等食品行業(yè)及藥品行業(yè)都得到了越來越多的應(yīng)用[6-8]。目前尚未有以超聲波協(xié)同纖維素酶法提取錦燈籠果實多糖方面的研究報導(dǎo)。故實驗采用超聲波協(xié)同纖維素酶法對錦燈籠果實多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[9]。超聲波與酶聯(lián)合提取多糖，通過將兩種方法結(jié)合提取多糖的方式，大大加速了多糖的溶出，具有條件溫和、雜質(zhì)易除和提取率高等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

錦燈籠：由西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室馮永輝教授鑒定；D-無水葡萄糖對照品：110833-201205，中國食品藥品檢定研究院；纖維素酶：10 000 U/g，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；苯酚、硫酸、氫氧化鈉等均為分析純，市售。

電子天平：SQP，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗器：KQ-250B，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：DZKW-D-2，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；干燥箱：101-1，上海市實驗儀器總廠；紫外-可見分光光度計：UV-160A，上海精密儀器廠；酸度計：PHS-3C，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

稱取5 g錦燈籠干燥果實，加入一定量的纖維素酶再加入一定量的純化水，然后調(diào)節(jié)pH。在超聲波提取后水浴酶解，水浴酶解后90 ℃滅酶30 s，抽濾，得到錦燈籠果實多糖提取液[10]。

1.3 錦燈籠多糖含量測定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取無水葡萄糖對照品12.5 mg，置250 mL容量瓶中，加純化水適量溶解，然后稀釋至刻度，搖勻，即得0.05 mg/mL的對照品溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 苯酚溶液的配制

精密稱取苯酚5.001 1 g，加純化水稀釋，待完全溶解，定容至100 mL( 棕色瓶保存),w(苯酚)=5%，放置冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取1.3.1節(jié)標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL具塞試管中，然后加純化水補至2.0 mL，再各精密加入配制好的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min。置40 ℃水浴中保溫15 min。取出，迅速在冰水浴中冷卻至室溫，然后在490 nm的波長處測定吸光度。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，ρ(葡萄糖)(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出回歸方程：y=68x+0.251 8，R2=0.998 3。

1.3.4 樣品分析

精密量取1.0 mL錦燈籠果實提取液用純化水定容至250 mL，然后精密量取1.0 mL稀釋后的溶液，置10 mL具塞試管中，再加純化水1.0 mL。照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，依法測定吸光度。即各精密加入配制的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min。置40 ℃水浴中保溫15 min。取出，迅速在冰水浴中冷卻至室溫，然后在490 nm的波長處測定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出供試品溶液中含葡萄糖的質(zhì)量，計算提取率[11]。

錦燈籠多糖提取率(%)=nρV0/1 000m×100%

式中，n為稀釋倍數(shù)；ρ為錦燈籠多糖提取液的質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為錦燈籠樣品液的總體積，mL；m為稱取的錦燈籠干燥果實的質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素實驗

稱取錦燈籠干燥果實5.0 g，預(yù)設(shè)料液比(錦燈籠粉末的質(zhì)量∶水的體積，下同)1∶10 g/mL、w(纖維素酶)=3%、超聲時間30 min、酶解時間60 min、pH=4.0、超聲溫度50 ℃、酶解溫度50 ℃為工藝流程中的常規(guī)量，以料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)、w(纖維素酶)(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%)、超聲時間(10、20、30、40、50、60 min)、酶解時間(30、40、50、60、70、80 min)、pH值(2、3、4、5、6、7)、超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃)6個單因素變量替換工藝流程中相應(yīng)的常規(guī)量，按照1.2和1.3.4實驗步驟提取和測定，然后計算錦燈籠提取液多糖得率。

1.3.6 顯著因素的篩選設(shè)計

根據(jù)單因素實驗確定的料液比、w(纖維素酶)、超聲時間、酶解時間、pH值、超聲溫度6個影響因素的最適條件范圍，采用Minitab 17軟件進(jìn)行因素水平設(shè)計見表1。

表1 Plackett-Burman實驗設(shè)計因素水平表及編碼

1.3.7 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗設(shè)計

利用Box-Behnken實驗設(shè)計原理[12-14]，以Plackett Burman實驗確定的4個對錦燈籠多糖得率影響顯著的因素，使用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行四因素三水平的實驗設(shè)計(見表2)，建立數(shù)學(xué)回歸模型并分析。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平編碼

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

各因素對錦燈籠多糖得率影響情況見表3、表4。

表3 不同處理組對錦燈籠多糖得率的影響

表4不同處理組對錦燈籠多糖得率的影響

酶解時間/min多糖得率/%pH值多糖得率/%超聲溫度/℃多糖得率/%302.5142.45403.24402.8653.54503.71503.1263.15603.54603.5173.36703.18703.54803.62

由表3、表4可見，綜合數(shù)據(jù)以及能源消耗等方面考慮，料液比選擇1∶10～1∶20 g/mL較為適宜。

酶催化的實質(zhì)是酶與底物相結(jié)合，從而減小反應(yīng)物的活化能，提高反應(yīng)的速率。所以，反應(yīng)速率在很大程度上是取決于酶與底物復(fù)合物形成的速率。從酶解效果以及耗材等方面考慮，w(纖維素酶)選在2%～4%較為適宜[15]。

從數(shù)據(jù)可以看出，超聲時間在30 min時錦燈籠多糖的得率達(dá)到最大。綜合能耗等問題，超聲時間選擇在20～40 min較為適宜。

酶解時間從生產(chǎn)效率等方面考慮酶解時間選擇在50～70 min較為適宜。

pH值不同會使得酶與底物結(jié)合的速度也不同，這可能是由于酸堿度會影響酶的催化速度以及酶自身的活性。因此，pH值選擇4.0～6.0較為合適。

由數(shù)據(jù)可以得出，當(dāng)提取溫度過高時，錦燈籠多糖的提取率會隨著溫度的升高而下降。因此，超聲溫度選擇在40～60 ℃較為適宜。

2.2 Plackett Burman實驗設(shè)計及篩選關(guān)鍵因素結(jié)果

對表1進(jìn)行實驗設(shè)計及結(jié)果效應(yīng)評價，結(jié)果見表5、表6。

表5 Plackett Burman實驗設(shè)計及響應(yīng)值

表6 Plackett Burman實驗設(shè)計各因素效應(yīng)評價

1) **表示極顯著(P<0.01)；*表示顯著(P<0.05)；P>0.05為不顯著。

由表6的結(jié)果可以看出，影響錦燈籠多糖得率的因素從強到弱排序依次為：C>A>B>D>F>E。其中超聲時間對錦燈籠多糖得率的影響達(dá)到極顯著水平，料液比、纖維素酶添加量和酶解時間達(dá)到顯著水平，而超聲溫度和pH值對錦燈籠多糖得率的影響不顯著。因此，選擇超聲時間、料液比、纖維素酶添加量和酶解時間這四個因素作為四因素三水平的響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計和分析的因素。根據(jù)數(shù)據(jù)分析和節(jié)約成本等原則，將超聲溫度和pH值這兩個因素固定在較好水平上，即超聲溫度為50 ℃，pH值為5.0進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 錦燈籠多糖提取響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

在Plackett Burman實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，考察A、B、C、D 對應(yīng)的x1、x2、x3、x4四個變量對錦燈籠多糖得率的影響，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表7。

表7 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗方案及結(jié)果

式中，Y為錦燈籠多糖得率，%。

進(jìn)一步對該模型及回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表8。

表8 回歸方程各項的方差分析

1) 同表6。

由軟件對回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析獲得錦燈籠多糖得率的最佳條件為料液比1∶15.586g/mL、w(纖維素酶)為3.4%、超聲時間29.97min和酶解時間59.73min，在此條件下，預(yù)測錦燈籠多糖的得率最大理論值為13.91%。

2.4 優(yōu)化條件下錦燈籠多糖得率的驗證結(jié)果

考慮到實際操作的方便性，將上述最佳條件調(diào)整為料液比1∶15.6g/mL、w(纖維素酶)=3.4%、超聲時間30min和酶解時間60min，并結(jié)合pH=5.0，超聲溫度50 ℃進(jìn)行3次平行錦燈籠多糖提取實驗，錦燈籠多糖得率(13.77%、13.80%、13.78%)平均值為13.78%。實際值與預(yù)測值的RSD(相對標(biāo)準(zhǔn)差)為0.467%，差異不顯著。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的參數(shù)基本準(zhǔn)確可靠，具有一定的實用價值。

3 結(jié) 論

在超聲波協(xié)同酶法提取錦燈籠多糖的過程中，料液比、酶添加量、超聲時間、酶解時間、pH值、超聲溫度等因素均對提取率有影響。通過單因素實驗、PlackettBurman實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化實驗對超聲波協(xié)同酶法提取錦燈籠果實多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。得到影響錦燈籠多糖得率的4個顯著因素，以及最佳提取工藝條件參數(shù)為料液比1∶15.6g/mL、w(纖維素酶)=3.4%、超聲時間30min、酶解時間60min、pH=5.0和超聲溫度50 ℃，錦燈籠多糖得率平均為13.78%，與預(yù)測值(13.91%)的相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.467%，差異不顯著。

結(jié)果表明超聲波協(xié)同酶法具有高效、省時等優(yōu)點，為纖維素酶法聯(lián)合超聲波處理技術(shù)在錦燈籠多糖提取過程中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

[1] 高品一,金梅,杜長亮,等.中藥錦燈籠的研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2014,31(9):732-735.

[2] 鐘方麗,薛健飛,劉威振.超聲波輔助法提取錦燈籠宿萼中的木犀草素[J].ODD&MACHINERY,2012,28(1)：171-174.

[3]OLIVEIRAI，ANABELAS，ISABELCFR，etal．Totalphenols，antioxidantpotentialandantimicrobialactivityofwalnut(Juglansregia L．)greenhusks[J]．FoodChemToxicol, 2008，46(7):2326-2331．

[4] 何念武，高一明．商南泉茗茶多糖的體外抗腫瘤活性[J]．商洛學(xué)院學(xué)報，2015，29(4)：51-56．

[5] 薛丹,黃豆豆,黃光輝,等.植物多糖提取分離純化的研究進(jìn)展[J].JournalofChineseMedicinalMaterials,2014,37(1)：157-161.

[6] 宣麗,齊森,劉春德,等.一種多糖保健掛面及其制備方法：104055034A[P].2014-09-24.

[7] 徐立華,楊福國,劉福嶺,等.一種具有抗輻射功能的復(fù)合多糖保健食品及其制備工藝：104543666A[P].2015-04-29.

[8] 鄭永飛.活性多糖的保健功能及其應(yīng)用[J].糧食與食品工業(yè),2009,16(4):22-25.

[9] 陸兔林,吳楊,季德,等.五味子多糖提取分離和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志, 2014,39(4):751-754.

[10] 胡成旭,侯欣彤,馮永寧,等.響應(yīng)面法優(yōu)化云芝多糖提取條件的研究[J].食品工藝科技,2007,28(7):124-130.

[11] 竇毅芳,劉飛,張為華.響應(yīng)面建模方法的比較分析[J].工程設(shè)計學(xué)報,2007, 14(5):359-363.

[12] 關(guān)海寧,刁小琴,馬松艷.玉米須多糖的超聲輔助酶法提取及抑菌作用研究[J].食品工業(yè),2012,33(6):15-18.

[13] 王曉林,鐘方麗,陳帥,等.超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取錦燈籠宿萼多糖工藝優(yōu)化[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015,46(6)：1079-1084.

[14] 國家藥典委員會.中國藥典(Ⅰ部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：232-233.

[15] 黎英,陳雪梅,嚴(yán)月萍,等.超聲波輔助酶法提取紅腰豆多糖工藝優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2015,31(15)：293-301.