儀民，儀慧蘭，吳麗華

1. 山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，太原030006 2. 太原師范學(xué)院 生物系，太原030031 3. Department of Statistics, University of Missouri Columbia, Columbia, MO 65211, USA

鉻(Cr)廣泛存在于人類生存環(huán)境中，除金屬鉻外，最常見(jiàn)的價(jià)態(tài)是Cr(Ⅲ)和Cr(VI)。全球鉻產(chǎn)量每年數(shù)千萬(wàn)噸，其中60%～70%的鉻用于包括不銹鋼在內(nèi)的合金生產(chǎn)，15%用于化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)，主要是制革、顏料和電鍍[1]。工業(yè)排放及農(nóng)業(yè)灌溉、施肥向環(huán)境釋放鉻，對(duì)環(huán)境微生物生態(tài)、動(dòng)植物生理和人體健康產(chǎn)生了顯著影響[2-6]。Cr(Ⅲ)不溶于水，移動(dòng)性差，而Cr(VI)易溶于水，移動(dòng)性較高，釋放到土壤和水體中的Cr(VI)導(dǎo)致飲用水Cr(VI)超標(biāo)[7-8]。近年來(lái)鉻污染事件在世界各地均有發(fā)生，鉻毒性受到全社會(huì)的關(guān)注。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)Cr(VI)毒性，本文采用毒理學(xué)研究方法，通過(guò)飲水染毒方式研究Cr(VI)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小白鼠體內(nèi)的蓄積效應(yīng)和毒性，旨在為鉻污染的安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康昆明種純系雄性小白鼠50只，體重(18 ± 2) g，由山西醫(yī)科大學(xué)提供。將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，稱量并記錄小鼠體重。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道中小鼠鉻半致死劑量(LD50=316 mg·kg-1)[14]，設(shè)置小鼠飲用水中含鉻(用重鉻酸鉀配制)濃度為15 mg·L-1，30 mg·L-1，50 mg·L-1和70 mg·L-1。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由取食和飲水，喂食山西醫(yī)科大學(xué)提供的專用全價(jià)大顆粒飼料，對(duì)照組飲用滅菌蒸餾水，鉻染毒組分別飲用不同濃度的鉻溶液。染毒期為30 d，觀察記錄期間動(dòng)物的活動(dòng)情況、飲食情況、精神狀態(tài)和中毒癥狀。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖與取材

染毒結(jié)束后稱量小鼠體重，用頸椎脫臼法處死，迅即解剖觀察體內(nèi)有無(wú)異常，摘取腦、心、肝、肺、腎、睪丸、脾臟等臟器，用預(yù)冷的生理鹽水浸洗，吸去表面浮水后稱重，置于玻璃瓶中備鉻含量測(cè)定。

1.4 骨髓細(xì)胞ROS和微核檢測(cè)

取小鼠股骨骨髓細(xì)胞，常規(guī)涂片，吉姆薩染液染色后鏡檢。每只動(dòng)物觀察約1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，計(jì)數(shù)有微核的PCE數(shù)，計(jì)算細(xì)胞微核率。

圖1 飲用含鉻水對(duì)小鼠體重的影響Fig. 1 Effects of Cr (Ⅵ) intake by drinking water on body weight in mice

圖2 飲用含鉻水對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響Fig. 2 Effects of Cr (Ⅵ) intake on the ratio of organ to body weight in mice

取小鼠股骨骨髓細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液制備細(xì)胞懸液，加入活性氧特異性熒光探針DCFH-DA(終濃度5 μmol·L-1)避光孵育30 min，熒光顯微鏡(BX51, Japan, Olympus)觀察、拍照，并用顯微成像系統(tǒng)附帶的Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)ROS熒光信號(hào)進(jìn)行定量分析。

1.5 鉻含量測(cè)定

取動(dòng)物臟器加入體積比為5:1的硝酸:高氯酸溶液，加熱硝化。三蒸水溶解硝化物，二苯碳酰二肼分光光度法(GB 7467—87)測(cè)定鉻含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)后，用Duncan方法比較染毒組與對(duì)照組間的差異顯著性(*P<0.05, 差異顯著；**P<0.01, 差異顯著)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 對(duì)小鼠鉻攝入量的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未出現(xiàn)死亡，攝食和精神狀態(tài)未見(jiàn)異常，但隨著飲用水中鉻含量的升高，小鼠的平均日飲水量減少。5個(gè)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的平均周飲水量按鉻濃度由低到高依次為352.3 mL、329.4 mL、294.1 mL、223.8 mL和208.2 mL。由周飲水量和體重計(jì)算各組小鼠的鉻攝入量發(fā)現(xiàn)，隨著飲用水中鉻濃度的升高，小鼠對(duì)鉻的攝入量遞增，4個(gè)鉻染毒組小鼠的鉻攝入量日均值依次為1.96 mg·kg-1、3.50 mg·kg-1、4.52 mg·kg-1和5.80 mg·kg-1。

圖3 飲用含鉻水對(duì)小鼠臟器鉻含量的影響Fig. 3 Effects of Cr (Ⅵ) intake on Cr contents in the organs of mice

2.2 對(duì)小鼠體重的影響

染毒30 d后各組小鼠的體重均有不同程度增加，其中，蒸餾水對(duì)照組體重增幅最大，為初始體重的2.08倍；4個(gè)不同濃度鉻染毒組體重明顯低于對(duì)照，體重增量為對(duì)照組的54.19 %～75.61%，說(shuō)明飲用水中高濃度六價(jià)鉻離子能影響小鼠的正常生理功能，進(jìn)而抑制小鼠體重的正常增長(zhǎng)(圖1)。

2.3 對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

解剖觀察未發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)異常，鉻染毒組小鼠主要臟器重量與體重的比值(臟體比)發(fā)生變化，其中，脾/體比值和腦/體比值升高，15 mg·L-1鉻染毒組脾/體比值顯著增高，50 mg·L-1鉻染毒組腦/體比值顯著增加了31%；腎/體比值與肝/體比值降低，腎/體比值降幅較大，在30～70 mg·L-1鉻染毒組中顯著降低；而心/體比值、睪丸/體比值和肺/體比值與對(duì)照組無(wú)明顯差異(圖2)。

計(jì)算染毒組與對(duì)照組小鼠臟器系數(shù)的相對(duì)值發(fā)現(xiàn)，雖然不同臟器對(duì)鉻毒性的敏感度不同，但隨著劑量增加，小鼠主要臟器的臟器系數(shù)均下降，說(shuō)明鉻攝入量的增加是導(dǎo)致機(jī)體損傷的主要原因。

2.4 對(duì)小鼠不同臟器鉻含量的影響

染毒30 d后，小鼠不同臟器內(nèi)總鉻含量的變化趨勢(shì)不盡相同(圖3)，反映了不同臟器鉻蓄積能力的不同。染毒組心臟鉻含量增幅最大，濃度50 mg·L-1和70 mg·L-1的染毒組總鉻含量顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的2.20和1.59倍。脾臟中鉻累積明顯，鉻含量為對(duì)照組的1.43～1.81倍。染毒組的睪丸、肺臟、肝臟中鉻含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但略有增加，其中睪丸中鉻含量為對(duì)照組的1.27～1.51倍，肺臟鉻含量為對(duì)照組的1.27～1.48倍，肝臟鉻含量為對(duì)照組的1.06～1.16倍。染毒組腎臟未發(fā)現(xiàn)鉻累積效應(yīng)。

2.5 對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞ROS水平和微核率的影響

不同劑量鉻染毒組小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率均增加。在鉻濃度15～70 mg·L-1范圍內(nèi)，細(xì)胞微核率顯著高于對(duì)照組，且隨著鉻濃度的增大而增加(圖4)。

經(jīng)特異性熒光探針標(biāo)記后，對(duì)照組細(xì)胞中僅可見(jiàn)微弱的熒光，而處理組骨髓細(xì)胞內(nèi)ROS熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)；定量分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞ROS水平在鉻染毒組中顯著增高，并具有一定的劑量依賴性(圖5，圖6)。這表明鉻染毒組小鼠骨髓細(xì)胞ROS水平升高，也提示鉻通過(guò)食道攝入能引發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓細(xì)胞的氧化脅迫。染毒組小鼠骨髓細(xì)胞ROS水平升高與骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率升高同時(shí)發(fā)生，說(shuō)明微核的產(chǎn)生與染毒組胞內(nèi)高水平的ROS有關(guān)。

圖4 鉻對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的影響Fig. 4 Effect of Cr (Ⅵ) intake on micronuclei frequency in mice marrow cells

圖5 小鼠骨髓細(xì)胞活性氧(ROS)熒光密度注：A, 對(duì)照組； B, 50 mg·L-1 Cr6+組。Fig. 5 Reactive oxygen species (ROS) fluorescence intensity in mice marrow cellsNote: A, Control; B, 50 mg·L-1 Cr6+.

圖6 鉻對(duì)骨髓細(xì)胞活性氧水平的影響Fig. 6 Effects of chromium on intracellular ROS levels in mouse marrow cells

3 討論 (Discussion)

本文采用昆明種小白鼠，經(jīng)飲水?dāng)z入較多Cr(VI)后，出現(xiàn)了體重增長(zhǎng)的抑制，與國(guó)內(nèi)外學(xué)者在其他品系小鼠和大鼠中得到的結(jié)果[15-16]類似。臟器系數(shù)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某器官質(zhì)量與其體重之比值，是亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)的常用指標(biāo)，可較好地反映化學(xué)物對(duì)該臟器的綜合毒害作用，臟器系數(shù)增大，表示該器官可能出現(xiàn)充血、水腫或增生肥大；臟器系數(shù)下降，說(shuō)明臟器萎縮或其他退行性病變[15]。飲水鉻染毒出現(xiàn)脾臟和腦的臟器系數(shù)增大，腎臟和肝臟臟器系數(shù)下降，心臟、睪丸和肺臟臟器系數(shù)無(wú)明顯改變；小鼠心臟和脾臟中鉻含量明顯提高，出現(xiàn)一定的鉻蓄積，而肝臟和腎臟未檢出鉻蓄積，說(shuō)明本研究染毒期間鉻的蓄積器官為心臟和脾臟，而毒效應(yīng)靶器官為肝臟和腎臟，腦和脾臟亦受到一定影響。本結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的肝臟、腎臟為鉻蓄積器官[16]不同，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系、染毒劑量、染毒期限不同造成的。因心臟和脾臟血流比較豐富，進(jìn)入體內(nèi)隨血液循環(huán)而轉(zhuǎn)運(yùn)的鉻有更多的機(jī)會(huì)滯留在其中，也有可能心和脾臟組織對(duì)鉻離子有較高的親和力，導(dǎo)致心臟和脾臟中鉻含量較高。經(jīng)口攝入的Cr(VI)因吸收率較低，多數(shù)由消化道隨糞便排出，其中被機(jī)體吸收的部分主要由尿液排出[16]。腎臟的基本功能是生成尿液，它是機(jī)體清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物、毒物的重要器官。腎臟中含鉻尿液的滯留增加了鉻對(duì)腎臟的毒性作用。肝臟是人體主要的代謝和解毒器官，鉻攝入引發(fā)的氧化脅迫及代謝紊亂會(huì)增加肝細(xì)胞負(fù)擔(dān)，引發(fā)對(duì)肝組織細(xì)胞的毒性作用[17-18]。因此，肝腎組織可能會(huì)因鉻的氧化損傷出現(xiàn)細(xì)胞死亡[17-19]，導(dǎo)致器官重量減輕，相應(yīng)的臟器系數(shù)下降。

微核是細(xì)胞受遺傳毒物作用后在細(xì)胞分裂過(guò)程中形成的形態(tài)學(xué)上的一種可見(jiàn)標(biāo)識(shí)，是檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性的主要指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)飲水?dāng)z入Cr(VI)可誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率升高，骨髓組織細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，說(shuō)明經(jīng)消化道攝入過(guò)量Cr(VI)能引發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓細(xì)胞的遺傳損傷和氧化脅迫。鉻遺傳毒性的出現(xiàn)，預(yù)示著細(xì)胞遺傳物質(zhì)的變異，及腫瘤發(fā)生或子代畸形的高風(fēng)險(xiǎn)。骨髓是動(dòng)物的干細(xì)胞庫(kù)，與機(jī)體造血功能、免疫細(xì)胞形成等密切相關(guān)，骨髓細(xì)胞受損會(huì)影響相關(guān)的造血過(guò)程、免疫功能等，引發(fā)機(jī)體生理異常。鉻染毒組小鼠體重增長(zhǎng)抑制可能與骨髓細(xì)胞氧化損傷，引發(fā)體內(nèi)供血不足繼而影響機(jī)體的正常生理過(guò)程有關(guān)。

綜上所述，六價(jià)鉻離子染毒30 d能引發(fā)小鼠的肝、腎毒性，使主要臟器內(nèi)總鉻含量改變，其中心臟和脾臟鉻含量顯著增高。

由消化道攝入的六價(jià)鉻離子，引發(fā)了骨髓組織細(xì)胞的氧化脅迫和遺傳損傷，與機(jī)體生理功能紊亂和疾病發(fā)生有關(guān)。

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