范曉季，宋昊，孫立偉，錢海豐,*

1. 浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，杭州 310032 2. 浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，杭州 310032 3. 浙江工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，杭州 310032

禾草靈是一種苯氧丙酸類除草劑，廣泛用于控制小麥、大麥和高爾夫球場中的一年生雜草[1]。禾草靈的主要作用機理是抑制乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的合成，使脂肪酸合成受阻，最后導(dǎo)致植物的死亡[2]。2000年，美國的禾草靈使用量約為350 t[3]，而中國的使用量約為1 000～5 000 t[4]。禾草靈的廣泛使用，導(dǎo)致其在環(huán)境中的殘留不可避免。有報道指出，農(nóng)藥在施用過程中，大部分(約73%)會灑落到土壤表面[5]，從而進(jìn)入土壤，并會隨地表徑流和雨水進(jìn)入環(huán)境水體，在加拿大的水體和空氣中都有檢出[6]，而禾草靈的降解產(chǎn)物禾草靈酸，在環(huán)境中較為穩(wěn)定，施藥126 d后的土壤中還有19%的殘留[5]。環(huán)境中殘留的禾草靈對大鼠具有雌激素活性[7]，還會干擾夜蛾雌激素的產(chǎn)生[8]，是一種內(nèi)分泌干擾物，會導(dǎo)致小鼠細(xì)胞增殖，引發(fā)癌變[9]。水體中的禾草靈會抑制銅綠微囊藻和小球藻的生長，但具體機制仍不清楚[10-11]。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，參與土壤的各類生物化學(xué)反應(yīng)，是物質(zhì)和能量循環(huán)的主導(dǎo)者之一[12]，在土壤氮、磷循環(huán)過程中起著重要作用[13]。土壤脲酶與土壤N元素的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[14]，其活性可以反映土壤的供氮能力[15]。土壤酸性磷酸酶是土壤中重要水解酶類，與土壤中C，N，P等多種元素的循環(huán)有密切關(guān)系[16-18]。土壤過氧化氫酶能分解土壤中的過氧化氫，對植物和微生物的生存具有重要意義[19]。土壤微生物的生物量和酶活性能在一定程度上反映土壤的狀況，對環(huán)境的變化反應(yīng)敏感，具有作為生態(tài)風(fēng)險評估生物指標(biāo)的價值[20-21]。據(jù)報道，在不同除草劑的作用下，土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的生物量有不同程度的降低，并且其抑制效果與除草劑濃度呈現(xiàn)正相關(guān)[22]。除草劑對玉米根際的土壤微生物量也有較為明顯的抑制效果[23]。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦處理60 d后的油茶林，其土壤多種酶活力顯著下降[24]。

然而，有關(guān)禾草靈對環(huán)境生物的影響的研究還比較少，缺乏對禾草靈潛在生態(tài)風(fēng)險的了解，因此本文通過檢測水稻生長的變化，結(jié)合檢測土壤酶活性和土壤微生物量來反映禾草靈對非靶標(biāo)植物和土壤微生物的影響，從而為評價禾草靈的生態(tài)風(fēng)險與合理使用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

水稻品種為秀水63(浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻研究所提供)。試驗所用土壤采自浙江省杭州市浙江工業(yè)大學(xué)上塘河畔，表面有苔蘚地衣層，去除表層約5 cm的表土，取5～10 cm處的土壤，用2 mm篩網(wǎng)去除石礫、植物根系及土壤動物，室溫保存?zhèn)溆?。所用禾草靈為R型禾草靈(純度為99.0%，浙江省農(nóng)科院提供)，無水乙醇(>99.7%，安徽安特食品股份有限公司)溶解，放于4 ℃冰箱保存待用。

1.2 種子培養(yǎng)與藥物處理

水稻種子用超純水浸泡15 min，沖洗多次，用2.5% NaClO(工業(yè)純，上海生工生物工程股份有限公司)浸泡消毒15 min，沖洗干凈。均勻置于鋪有紗布的塑料筐中，加入自來水濕潤紗布并保持種子濕潤，置于30 ℃的人工氣候箱中，黑暗條件下發(fā)芽。每天澆水，保持紗布濕潤。3 d后水稻種子萌芽，培養(yǎng)箱溫度改為28 ℃，并開始進(jìn)行光照，光周期12 h/12 h，光強為3 000 lx，繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

將培養(yǎng)7 d后的水稻幼苗移植到裝有300 g土壤的塑料小罐中，加入200 mL自來水至土壤上層有浮水，適應(yīng)培養(yǎng)2 d。隨后再加入100 mL禾草靈溶液，濃度分別為200 μg·L-1或1 000 μg·L-1，每個濃度設(shè)置4個平行；對照組加入等體積的自來水，之后每天加入50 mL的自來水，使土壤上始終保持有浮水。每個實驗進(jìn)行2次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 對水稻生長影響的檢測

加藥處理8 d后，取水稻幼苗根上部分，測得其鮮重，每個濃度6個平行。取水稻幼苗新鮮葉片30～50 mg，每個濃度6個平行，記錄其重量，加入2 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(>99.0%，如皋市金陵試劑廠)中，4 ℃避光保存24 h，取上清液用酶標(biāo)儀(powerwave XS，美國BIO-TEK公司)于647、664.5 nm波長下測定其吸光度值，代入公式(1)和(2)計算葉綠素的濃度。

Ca=12.7×OD664.5-2.79×OD647

(1)

Cb=20.7×OD647-4.62×OD664.5

(2)

式中Ca為葉綠素a的含量，Cb為葉綠素b的含量，以mg·L-1表示。

水稻幼苗黑暗處理30 min，并在黑暗條件下用葉綠素?zé)晒鈨x(MINI-PAM II，德國WALZ公司)測定水稻葉片的光合參數(shù)，每個濃度6個平行。其中，qP(photochemical quenching)表征光化學(xué)淬滅，即由光合作用引起的熒光淬滅，反映了光合活性的高低；Y(II)(photochemical yield of PSII)是任一光照狀態(tài)下光合系統(tǒng)II (PSII)的實際量子產(chǎn)量，表示實際光合能力；Y(NO)(unregulated non-photochemical quenching)是光損傷的重要指標(biāo)，表示非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量。

1.4 對土壤微生物影響的檢測

分別取加藥處理4 d和8 d的土壤，每個濃度4個平行，取樣時盡量不傷害水稻的根系。使用土壤DNA提取試劑盒(美國MOBIO公司)提取土壤總DNA，用16s進(jìn)行熒光定量PCR擴增，引物序列為338f(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518r(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)[25]，根據(jù)Ct(cycle threshold)值計算微生物拷貝數(shù)[26]，測定在不同濃度禾草靈暴露下土壤微生物量的變化。

1.5 土壤酶活的檢測

分別取禾草靈處理4 d和8 d的土壤，每個濃度4個平行，在室溫條件下風(fēng)干，之后分別使用土壤酸性磷酸酶(S-ACP)測試盒、土壤過氧化氫酶(S-CAT)測試盒、土壤脲酶(S-UE)測試盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)分別檢測土壤酸性磷酸酶、土壤過氧化氫酶和土壤脲酶的活性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL和STATVIEW 5.0.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實驗結(jié)果均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)，使用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行對照組和禾草靈加藥組之間的差異顯著性分析，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 禾草靈對水稻生長的影響

禾草靈暴露對水稻鮮重的影響如圖1所示。從中可以看出，200 μg·L-1禾草靈暴露8 d的水稻與對照組相比無差異(P>0.05)。當(dāng)濃度高至1 000 μg·L-1時，明顯抑制水稻幼苗的生長(P<0.05)，表現(xiàn)為植株矮小，葉片較小，并伴有葉片發(fā)黃、枯萎等現(xiàn)象，鮮重下降至對照組的55%。同時，高濃度禾草靈(1 000 μg·L-1)對水稻幼苗光合色素影響明顯(圖2)，其中葉綠素a和葉綠素b的含量顯著下降(P<0.05)，而低濃度(200 μg·L-1)禾草靈處理的水稻幼苗色素含量無變化(P>0.05)。

高濃度禾草靈(1 000 μg·L-1)處理8 d，水稻幼苗的qP和Y(II)顯著下降(P<0.05)，分別為對照組的78.7%、79.8%，Y(NO)值顯著上升(P<0.05)，為對照組的121.0%(圖3)。而低濃度禾草靈(200 μg·L-1)處理組的各熒光參數(shù)與對照組相比均沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖1 禾草靈暴露8 d對水稻幼苗鮮重的影響注：“*”代表顯著性差異，P<0.05。Fig. 1 Effect of diclofop-methyl on fresh weight of rice seedlings after 8 d of exposureNote：The asterisks (*) indicates a significant difference compared with the control groups (P < 0.05).

圖2 禾草靈暴露8 d對水稻幼苗色素含量的影響注：“*”代表顯著性差異，P<0.05。Fig. 2 Effect of diclofop-methyl on pigment content of rice seedlings after 8 d exposureNote：The asterisks (*) indicates a significant difference compared with the control groups (P< 0.05).

圖3 禾草靈暴露8 d對水稻幼苗葉片qP，Y(II)和Y(NO)的影響注：“*”代表顯著性差異，P<0.05。Fig. 3 Effect of diclofop-methyl on qP, Y(II) and Y(NO) of rice seedlings after 8 d exposureNote: The asterisks (*) indicates a significant difference compared with the control groups (P < 0.05).

2.2 禾草靈對土壤酶活性的影響

禾草靈處理4 d后，高濃度處理組的土壤脲酶、酸性磷酸酶和過氧化氫酶的活性均出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，下降幅度分別為8.9%、16.6%和10.2%，而在處理8 d后，其土壤酶活性又恢復(fù)至對照組水平(圖4)。而低濃度(200 μg·L-1)禾草靈處理對3種土壤酶活性均無影響。

2.3 禾草靈對土壤微生物量的影響

禾草靈處理4 d，低濃度組土壤微生物量沒有顯著變化(P>0.05)，高濃度組土壤微生物量顯著下降(P<0.05)，只有對照組的32.7%，；禾草靈處理8 d，低濃度處理組的土壤生物量顯著升高(P<0.05)，為對照組的158.2%，而高濃度組則與對照組沒有顯著差別(圖5) (P>0.05)。

3 討論 (Discussion)

葉璟等[27-28]研究發(fā)現(xiàn)，禾草靈對水稻的胚根生長有一定的抑制作用，并隨著濃度的升高抑制作用增強，對水稻植株的生長也有明顯的抑制作用，另外會引起銅綠微囊藻的細(xì)胞膜損傷。吡氟禾草靈對硬毛刺苞菊幼苗的生長有顯著的抑制作用，處理10 h即可觀察到葉脈褐變，32 h左右完全枯死[29]。禾草靈酸對擬南芥體外和體內(nèi)的葉綠體的希爾反應(yīng)均有顯著的抑制作用[27]。禾草靈酸對擬南芥的處理使植株根變短，副根數(shù)目減少，部分葉片發(fā)黃或發(fā)黑，葉綠體體積膨脹，淀粉顆粒顯著增加，說明葉肉細(xì)胞內(nèi)的糖代謝受阻[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度禾草靈(200 μg·L-1)處理后，水稻幼苗的鮮重和葉綠素含量，以及qP、Y(II)和 Y(NO)等光合作用參數(shù)均沒有明顯變化(P>0.05)，說明低濃度禾草靈對水稻的生長沒有影響。高濃度禾草靈(1 000 μg·L-1)處理的水稻幼苗生長受到抑制，鮮重和葉綠素含量顯著下降(P<0.05)，qP和Y(II)也顯著下降(P<0.05)，而Y(NO)顯著上升(P<0.05)。qP下降說明水稻的光合活性下降，Y(II)下降說明實際光合能力下降，而Y(NO)上升則表示水稻的光系統(tǒng)受損傷。這些結(jié)果說明高濃度禾草靈的暴露使水稻的葉綠素含量下降，光合系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致水稻的光合能力降低，最終抑制水稻的生長。

圖4 禾草靈處理對土壤酶活性的影響注：“*”代表顯著性差異，P<0.05。Fig. 4 Effects of diclofop-methyl on soil enzymes activityNote：The asterisks (*) indicates a significant difference compared with the control groups (P < 0.05); ACP, acid phosphatase; UE, urease; CAT, catalase.

圖5 禾草靈處理對土壤生物量的影響注：“*”代表顯著性差異，P<0.05。Fig. 5 Effect of diclofop-methyl on soil microbial biomassNote：The asterisks (*) indicates a significant difference compared with the control groups (P< 0.05).

土壤酶活性的結(jié)果顯示禾草靈對土壤酶活性有顯著的抑制作用，表現(xiàn)為高濃度禾草靈處理4 d時3種土壤酶活性均出現(xiàn)顯著下降(P<0.05) (圖4)。吳小虎等[26]研究發(fā)現(xiàn)乳氟禾草靈對土壤脲酶活性表現(xiàn)為抑制-激活效應(yīng)，后期恢復(fù)到對照水平。這與我們的研究結(jié)果相一致，本研究中禾草靈處理8 d后，3種土壤酶活性均回復(fù)到對照水平。多種使用廣泛的除草劑均會對土壤酶活性產(chǎn)生類似的抑制-激活效應(yīng)[24, 32-33]，這可能是因為禾草靈在土壤中易降解[34]，而其在水中的水解是毒性降低的過程[35]。

16s的拷貝數(shù)能反映土壤的微生物量，禾草靈的處理使土壤微生物的數(shù)量顯著降低(P<0.05)，說明禾草靈對土壤微生物有顯著的抑制作用，而處理后期土壤微生物的數(shù)量有一個明顯的回升趨勢，表現(xiàn)為低濃度禾草靈處理8 d后微生物量顯著高于對照組(P<0.05)。張妤等[36]研究發(fā)現(xiàn)二氯喹啉酸抑制土壤微生物總量。李立鑫等[18]發(fā)現(xiàn)常用除草劑對土壤微生物有一定程度的抑制作用，抑制作用隨著施藥時間的延長而降低。而孫約兵等[37]在研究中發(fā)現(xiàn)除草劑硝磺草酮對土壤微生物有促進(jìn)作用。

本研究證實高濃度禾草靈殘留對非靶標(biāo)植物的鮮重、葉綠素含量和光合作用均造成不良的影響，對土壤微生物的數(shù)量和功能有一定的抑制作用，但抑制作用隨著施用時間的延長而下降。本研究結(jié)果對于指導(dǎo)禾草靈的合理使用及其環(huán)境風(fēng)險的準(zhǔn)確評估方面均有一定的指導(dǎo)意義。

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