易先亮，孫樺奇，張可可，張明乾

大連理工大學(xué)食品與環(huán)境學(xué)院，盤錦 124221

有機(jī)錫常用作防污涂料、塑料、殺蟲劑和殺菌劑等的有效成分或添加劑，可以通過不同途徑大量地釋放到環(huán)境中，其中尤以三丁基錫(tributyltin)與三苯基錫(triphenyltin，TPT)對(duì)環(huán)境的影響最為嚴(yán)重，其在極低的環(huán)境濃度下即可引起軟體動(dòng)物、魚類等物種發(fā)生性畸變等[1]。盡管含有有機(jī)錫的防污涂料從20世紀(jì)80年代開始已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)被陸續(xù)禁用，但是TPT在其他領(lǐng)域(如殺蟲劑等)的廣泛應(yīng)用使其在海洋環(huán)境中的濃度在近年來仍然呈上升趨勢(shì)[2]。

海洋微藻作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中最主要的初級(jí)生產(chǎn)者，是海洋食物鏈的基礎(chǔ)。而硅藻作為分布廣泛的海洋微藻，其固碳量占全球海洋生態(tài)系統(tǒng)總固碳量的20%，因此其在海洋生態(tài)系統(tǒng)中起著十分重要的作用[3]。假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)是一種常見的海洋硅藻，在全球海域中均分布廣泛，此外，假微型海鏈藻是全球第一種被全基因測(cè)序的海洋真核藻類[4]。在海洋生態(tài)毒理學(xué)研究中，因其個(gè)體小、世代周期短、分布廣泛以及有已知的全基因序列等特點(diǎn)，已成為海洋生態(tài)毒理學(xué)研究中的理想物種。因此，本研究以假微型海鏈藻為實(shí)驗(yàn)物種，研究了在不同溫度條件下三苯基錫對(duì)其細(xì)胞生長以及光合作用的影響，為了解不同溫度下污染物對(duì)海洋微藻的毒性效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

假微型海鏈藻(CCMP 1015)的原始培養(yǎng)條件為：溫度(25±1) ℃，鹽度32.5‰±1‰(人工海水，0.45 μm濾膜過濾)，pH 7.8，光暗比為14 h:10 h，培養(yǎng)基為f/2-Si。本實(shí)驗(yàn)所使用的錐形瓶及其他玻璃器皿均在酸浴(蒸餾水：HNO3：HCl 體積比為 9:2:1)中浸泡至少24 h后以蒸餾水洗凈、烘干并滅菌。

實(shí)驗(yàn)用氯化三苯基錫(TPTCl；>95%)購自Sigma公司(Sigma-Aldrich，USA)。

1.2 生長抑制實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)置為：10 ℃、15 ℃、25 ℃和30 ℃。實(shí)驗(yàn)用假微型海鏈藻由25 ℃經(jīng)接種后置入上述4個(gè)溫度的恒溫水浴中，并在各自溫度下培養(yǎng)4個(gè)世代周期(> 28 d)以后進(jìn)行藻類生長抑制實(shí)驗(yàn)以及光合作用抑制實(shí)驗(yàn)。氯化三苯基錫(TPTCl)的暴露濃度設(shè)置為0.5、1、2、5、10 μg·L-1與海水空白以及溶劑對(duì)照組，除海水空白外，所有TPTCl暴露組與溶劑對(duì)照組中的助溶劑濃度均調(diào)整為0.05%二甲基亞砜(體積比)。具體暴露實(shí)驗(yàn)條件參照Yi等[5]的方法，本實(shí)驗(yàn)每組處理設(shè)置4個(gè)平行樣，暴露96 h后以的方法血小球計(jì)數(shù)板(Brand GmbH, Wertheim, Germany)確定藻的濃度并計(jì)算藻液的細(xì)胞密度。本研究中對(duì)照組中各平行間的生長率變異系數(shù)小于10%，符合國標(biāo)要求。

1.3 光合作用抑制實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)條件、暴露濃度設(shè)置與上述生長抑制實(shí)驗(yàn)完全一致。96 h暴露結(jié)束后，將所有樣品遮光2 h后，用熒光法來測(cè)量每組的藻類光合作用活性，包括photosystem II(PSII)最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)與PSII光化學(xué)能量轉(zhuǎn)化的有效量子產(chǎn)量(ФII)。熒光測(cè)量采用WATER-PAM fluorometer (Heinz WalzGmbH，Germany)，光照強(qiáng)度選取與儀器參數(shù)設(shè)置參考Yi等[5]方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將生長速率數(shù)據(jù)與光合作用數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism (version 5.00，GraphPad software，San Diego，USA)軟件中的sigmoidal log(dose)-response (variable slope)曲線擬合，以計(jì)算不同溫度下TPTCl對(duì)T. pseudonana的生長以及光合作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)及其95%置信區(qū)間(95%CI)。

不同溫度對(duì)細(xì)胞生長與光合作用速率的影響結(jié)果使用One-way ANOVA進(jìn)行分析，而溫度與污染物濃度兩因素間的聯(lián)合作用對(duì)假微型海鏈藻的生長以及光合作用的影響則采用Two-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。進(jìn)行ANOVA分析前，各組數(shù)據(jù)首先經(jīng)Levene檢驗(yàn)證明組間方差齊次(P>0.05)。上述分析均由SPSS(version 19，SPSS Inc., Chicago)完成。

2 結(jié)果(Results)

2.1 溫度對(duì)假微型海鏈藻的生長與光合作用的影響

通過方差分析發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組與助溶劑對(duì)照組中的假微型海鏈藻生長無明顯差異，表明0.05%二甲基亞砜對(duì)此種微藻的生長沒有影響。溫度條件對(duì)假微型海鏈藻的細(xì)胞生長與光合作用有顯著影響(見圖1)，在25 ℃條件下，假微型海鏈藻的細(xì)胞增長最快，每天的細(xì)胞增長數(shù)目為其他溫度下的2倍，而在10 ℃、15 ℃以及30 ℃條件下，假微型海鏈藻的藻細(xì)胞密度增長沒有顯著性差異(n=4，one-way ANOVA檢驗(yàn)，P>0.05)。此外，溫度條件對(duì)假微型海鏈藻的光合作用參數(shù)也有顯著影響，在30 ℃條件下，F(xiàn)v/Fm與ФII兩項(xiàng)參數(shù)均顯著低于其他溫度下的值(one-way ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05)，而此兩項(xiàng)參數(shù)在10 ℃、15 ℃與25 ℃下無顯著性差異。

圖1 不同溫度對(duì)假微型海鏈藻的生長(a)與光合作用(b、c)的影響Fig. 1 Effect of temperature on the growth rate (a) and photosynthesis parameters (b, c) of Thalassiosira pseudonana

2.2 溫度對(duì)TPTCl毒性的影響

在不同溫度下，TPTCl對(duì)假微型海鏈藻的生長及光合作用抑制的IC50如表1所示。生長抑制為相對(duì)較為敏感的毒性終點(diǎn)，TPTCl在10 ℃、15 ℃、25 ℃與30 ℃下對(duì)生長抑制的IC50值分別為1.81、1.69、1.09、0.73 μg·L-1，這些值均低于在同一溫度下其對(duì)光合作用參數(shù)的IC50值。而Fv/Fm則相對(duì)最不敏感，尤其是在10 ℃與15 ℃條件下，IC50值均大于10 μg·L-1。以10 ℃為例，與對(duì)照組相比，ФII的抑制率在本實(shí)驗(yàn)最高暴露濃度10 μg·L-1下為83%，而Fv/Fm的抑制率僅為28%(圖2)。

總的來說，TPTCl對(duì)假微型海鏈藻的3個(gè)不同試驗(yàn)終點(diǎn)的IC50值隨著溫度的上升呈下降趨勢(shì)。Two-way ANOVA分析結(jié)果表明，TPTCl的濃度與溫度的交互作用對(duì)Fv/Fm與ФII均有顯著影響，此外，溫度與TPTCl濃度2個(gè)因素分別對(duì)光合作用參數(shù)均有顯著影響(表2)。

3 討論(Discussion)

3.1 溫度對(duì)假微型海鏈藻的生長與光合作用的影響

溫度對(duì)海洋微藻的生長與光合作用均有顯著的調(diào)節(jié)作用。假微型海鏈藻對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較廣，在本實(shí)驗(yàn)中的溫度范圍10～30 ℃條件下均可生長，與其他很多海洋硅藻如半裸舟形藻、雙尖菱板藻細(xì)頭變種和菱形藻類似，25 ℃為其最適生長溫度[6]。溫度可以影響微藻體內(nèi)的合成蛋白與多糖酶的活性，合成酶處于最適條件下時(shí)，細(xì)胞增長的速度最快。在一定的適宜溫度范圍內(nèi)，溫度升高使得細(xì)胞內(nèi)部的化學(xué)和酶促反應(yīng)加快，硅藻的生長也相應(yīng)加快。而當(dāng)溫度超出適宜范圍之后，細(xì)胞內(nèi)的某些組分以及蛋白質(zhì)、核酸會(huì)受到不可逆的損害，并導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)能急劇下降。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，假微型海鏈藻的生長速率很低，而光合作用同樣受到顯著的影響[7]。在較低溫度時(shí)，細(xì)胞新陳代謝的化學(xué)反應(yīng)速率會(huì)減慢，硅藻的生長速率也會(huì)受到抑制。與高溫條件不同的是，低溫下，假微型海鏈藻的光合作用并未受到影響，此結(jié)果與溫度對(duì)另外2種硅藻(三角褐指藻、中肋骨條藻)的光合作用參數(shù)影響均一致[8-9]。低溫脅迫對(duì)植物光合作用的影響是多方面的，針對(duì)溫度對(duì)硅藻光合作用影響的試驗(yàn)結(jié)果表明，盡管低溫暴露可以降低硅藻利用光能的能力，但這種影響可逆，暴露一定時(shí)間后，硅藻能逐漸啟動(dòng)恢復(fù)機(jī)制。由于本實(shí)驗(yàn)中，T. pseudonana已在低溫條件下培養(yǎng)4代以上，因此，低溫條件并未影響其光合作用。相反的，高溫造成的損耗不可逆，這種損耗可能表現(xiàn)為PSII最大光化學(xué)轉(zhuǎn)換效率及實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率的降低，以及PSII的潛在活性以及光合電子傳遞速率的抑制等[9]。

表1 不同溫度下三苯基錫對(duì)假微型海鏈藻的生長以及光合作用的半數(shù)抑制濃度(IC50，μg·L-1)及95%置信區(qū)間(95%CI)Table 1 IC50(μg·L-1) of triphenyltin chloride (TPTCl) on the growth and photosynthesis inhibition for Thalassiosira pseudonana at different temperatures

注：*NA表示95%CI無法從劑量-效應(yīng)曲線中得出。

Note:*NA, not available (95%CI was not able to be obtained from the dose-response curve).

3.2 TPTCl對(duì)假微型海鏈藻的毒性作用

在25 ℃條件下，TPTCl對(duì)幾種海洋毒理學(xué)模式物種如日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)、輪蟲(Brachionus koreanus)以及海水青鳉魚(Oryzias melastigma)的LC50值分別為6.3、29.6、20.5 μg·L-1[10-12]。而假微型海鏈藻對(duì)TPTCl較敏感，IC50值與小型浮游動(dòng)物或魚相比較低。而TPT與另外一

種有機(jī)錫TBT對(duì)假微型海鏈藻的毒性相近，氧化三丁基錫(TBT oxide)對(duì)其96 h-IC50值為1.4 μg·L-1 [13]。Yi等[5]的研究表明，低濃度與高濃度的TPTCl對(duì)假微型海鏈藻的毒性效應(yīng)機(jī)制有顯著區(qū)別。在低濃度TPTCl暴露下(< 0.5 μg·L-1)，假微型海鏈藻自身的解毒機(jī)制被激活，非光化學(xué)猝滅系數(shù)(non-photochemical quenching)增大可以保護(hù)PSII并維持光合作用過程的穩(wěn)定，MnSOD與OEE1等蛋白質(zhì)的表達(dá)量升高以抵御過量的胞內(nèi)活性氧。而較高濃度的TPTCl(> 1.0 μg·L-1)可直接破壞部分蛋白功能，抑制代謝，并最終抑制藻類的生長與光合作用。

圖2 不同溫度下TPTCl (μg·L-1)對(duì)假微型海鏈藻的(a)Fv/Fm與(b)ФII的影響Fig. 2 Effect of TPTCl on the (a) Fv/Fm and (b) ФII at different temperatures (℃)

DegreeoffreedomFvalueSignificancelevelFv/FmTemperature3882.44<0.001TPTCl61959.90<0.001Interactingeffect18175.36<0.001ФIITemperature398.28<0.001TPTCl61320.79<0.001Interactingeffect1819.71<0.001

3.3 溫度對(duì)TPTCl毒性的影響及其種間特異性

Lau等[14]針對(duì)溫度對(duì)9種不同化學(xué)物質(zhì)的毒性的影響進(jìn)行了元分析，結(jié)果顯示，LC50值隨溫度的升高呈“倒V型”變化趨勢(shì)，即化學(xué)物質(zhì)在最適生長溫度下的LC50值最高，毒性最低，而LC50值隨著溫度的升高或降低均呈下降趨勢(shì)。比如，對(duì)于海水青鳉，TPTCl在20 ℃的LC50最大[12]。然而，此結(jié)論并非適用于所有生物。由于不同物種的種間特異性，溫度對(duì)污染物毒性的影響對(duì)不同的物種呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。例如，TPTCl對(duì)小型浮游動(dòng)物日本虎斑猛水蚤與輪蟲的LC50與溫度的升高均呈負(fù)相關(guān)[12]。本研究中，TPTCl對(duì)假微型海鏈藻的毒性隨溫度變化的趨勢(shì)與小型浮游動(dòng)物類似。

上述溫度對(duì)污染物毒性影響的種間特異性可能與污染物對(duì)不同物種的毒性效應(yīng)機(jī)制(如靶器官以及代謝途徑等)不同有關(guān)。一般對(duì)于魚類(以海水青鳉魚為例)來說，溫度升高使其代謝速率加快，并進(jìn)一步促進(jìn)污染物的攝入量與污染物在其體內(nèi)的生物積累[15]。而低溫條件可引起供氧不足，從而改變糖酵解的路徑并最終導(dǎo)致魚個(gè)體需要更多能量來維持蛋白功能，因此，魚類在低溫條件下對(duì)污染物也相對(duì)更加敏感[16]。對(duì)于小型浮游動(dòng)物來說，溫度升高引起的污染物毒性變化的原因與魚類相似[17]。而在低溫條件下，小型浮游動(dòng)物如T. brevicornis等會(huì)進(jìn)入休眠狀態(tài)，進(jìn)而抑制新陳代謝速率，減少污染物的攝入量與生物積累，此種狀態(tài)是對(duì)低溫條件下節(jié)約能量的一種適應(yīng)性[18]。

致謝：感謝周豪博士在本文撰寫過程中給予的指導(dǎo)與幫助。

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