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        結(jié)締組織生長因子在腎積水模型大鼠腎組織中的表達研究

        2017-03-14 08:24:20劉永東韓建強張廣平李俊峰張傳光胡強
        浙江醫(yī)學 2017年4期
        關(guān)鍵詞:腎積水組織化學腎盂

        劉永東 韓建強 張廣平李俊峰 張傳光 胡強

        結(jié)締組織生長因子在腎積水模型大鼠腎組織中的表達研究

        劉永東 韓建強 張廣平李俊峰 張傳光 胡強

        目的觀測結(jié)締組織生長因子(CTGF)在腎積水模型大鼠腎組織中的表達,并與先天性腎積水患兒進行對比,為先天性腎積水的靶點防治研究提供可靠的動物模型。方法將48只成年健康雄性Wistar大鼠分為模型組和對照組各24只。模型組行左側(cè)腎盂輸尿管處游離并結(jié)扎輸尿管,對照組僅行左側(cè)腎盂輸尿管處游離。兩組在術(shù)后1、2、4、8周各隨機選取6只,行腎臟病理學檢查,用免疫組織化學染色及Western blot法檢測CTGF在組織中的分布及蛋白的表達水平。結(jié)果CTGF蛋白含量隨著梗阻時間延長而增加。CTGF在模型組腎臟中各時點的表達明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。結(jié)論CTGF在大鼠腎積水模型中為陽性表達,且與梗阻時間呈正相關(guān),與前期先天性腎積水患兒的研究結(jié)果相一致,此模型可用于先天性腎積水的CTGF靶點防治。

        大鼠 腎積水 結(jié)蹄組織生長因子

        腎盂輸尿管連接處梗阻(ureteropelvic junction obstruction,UPJO)所致腎積水可使腎臟發(fā)生一系列的生理、病理變化,最終導(dǎo)致腎萎縮并纖維化。動物研究表明,轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表達是介導(dǎo)間質(zhì)纖維化過程的關(guān)鍵機制,而結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是TGF-β1致纖維化作用的下游關(guān)鍵性效應(yīng)因子,在促進成纖維細胞轉(zhuǎn)分化、合成與分泌膠原蛋白等細胞外基質(zhì)的過程中發(fā)揮重要作用[1]。本研究通過應(yīng)用免疫組織化學及Western blot法檢測CTGF在組織中的分布及蛋白的表達水平,以明確CTGF在腎積水模型大鼠腎組織中的表達,從而為先天性腎積水的靶點防治提供可靠的動物模型。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物成年健康雄性Wistar大鼠48只,體重170~190g,由濰坊醫(yī)學院動物室提供,常規(guī)飼養(yǎng)1周,期間無大鼠死亡。

        1.2 試劑及儀器SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司);BCA蛋白質(zhì)定量測定試劑盒、蛋白裂解液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);預(yù)染蛋白Marke、GAPDH抗體(北京博奧森公司);即用型SABC免疫組織化學染色試劑盒、兔抗大鼠CTGF多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

        1.3 動物分組及模型建立將大鼠分為模型組和對照組各24只。模型組采用3-0絲線結(jié)扎制備單側(cè)完全性輸尿管梗阻模型,以氯胺酮8mg/kg腹腔注射麻醉,固定備皮消毒,取腹正中切口,找到左側(cè)腎盂輸尿管并游離,距腎盂輸尿管連接處1cm雙重絲線結(jié)扎并切斷輸尿管,隨后逐層關(guān)閉腹腔;對照組打開腹腔后僅行左側(cè)腎盂輸尿管處游離。

        1.4 病理學檢查兩組大鼠在術(shù)后1、2、4、8周各隨機選取6只,氯胺酮腹腔注射麻醉,固定備皮消毒,取腹正中切口,找到左側(cè)腎臟,取腎臟標本,行腎臟病理學檢查。

        1.4.1 HE染色將石蠟切片依次脫蠟,梯度乙醇水化,HE染色,梯度乙醇脫水,透明,固封,顯微鏡下觀察腎小球及腎小管間質(zhì)的變化。

        1.4.2 免疫組織化學染色采用SABC法,石蠟標本切片后放恒溫箱,取出后二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化;3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化酶;PBS緩沖液處理0.02mol/L檸檬酸微波修復(fù);非免疫性動物血清封閉非特異性抗原;兔抗大鼠CTGF多克隆抗體稀釋度為1∶100,4℃孵育過夜;按SP免疫組化試劑盒說明加生物素標記的二抗,孵育30min后加標記過氧化酶的鏈霉親和素孵育30min;DAB顯色,以PBS代替一抗作為陰性對照。經(jīng)蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片處理。同時取先天性腎積水患兒的腎臟標本作陽性對照,顯微鏡下觀察陽性顆粒的分布及表達水平。

        1.4.3 Western blot法將兩組大鼠腎臟標本盡量剪碎,加入裂解液內(nèi)30min,然后在4℃下12 000r/min離心5min,提取上清液,BCA法測定蛋白濃度,進行10% SDS-PAGE垂直凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)),兔抗大鼠CTGF多克隆抗體,稀釋比例均為1∶2 000,均4℃孵育過夜,TBST洗10min×3次。HRP標記的山羊抗兔多克隆IgG二抗(THERMO)稀釋比例為1∶5 000,37℃孵育1h,TBST洗10min×3次。滴加ECL化學發(fā)光試劑,顯影、攝片,測定蛋白濃度。

        1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗。

        2 結(jié)果

        2.1 HE染色結(jié)果對照組腎臟各部位無明顯病理變化,腎小球及腎小管間質(zhì)無明顯異常改變(圖1a)。與對照組相比,模型組隨著梗阻時間延長,腎小管擴張逐漸明顯,腎實質(zhì)區(qū)腎小球萎縮(圖1b)。

        圖1 HE染色結(jié)果(a:對照組,正常腎實質(zhì);b:模型組,腎積水腎實質(zhì);HE染色,×200)

        2.2 免疫組織化學染色結(jié)果CTGF蛋白染色陽性信號為棕黃色顆粒,陰性則無棕黃色著色。正常腎組織無或僅有微量表達,染色為顆粒狀,著色稀疏(圖2a)。而在模型組則表達增多,主要集中在腎小管上皮細胞胞質(zhì)及腎間質(zhì)中,并隨梗阻時間延長染色強度加重且數(shù)量增多(圖2b)。采用先天性腎積水患兒腎臟腎實質(zhì)免疫組織化學染色作陽性對照,可見CTGF在腎小管上皮細胞胞質(zhì)中表達明顯(圖2c)。

        2.3 兩組大鼠腎組織CTGF蛋白定量比較CTGF在模型組腎臟中呈陽性表達,且CTGF蛋白含量隨著梗阻時間延長而增加,各時點表達水平明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01),見表1和圖3。

        圖2 免疫組織化學染色結(jié)果(a:對照組正常腎實質(zhì),CTGF無明顯陽性表達;b:模型組腎積水腎實質(zhì),CTGF在腎小管上皮細胞胞質(zhì)、腎間質(zhì)組織中表達明顯;c:先天性腎積水患兒腎臟腎實質(zhì),CTGF在腎小管上皮細胞胞質(zhì)中表達明顯;SABC法,×200)

        表1 兩組大鼠腎組織CTGF蛋白定量比較

        圖3 Western blot法檢測兩組大鼠腎組織中CTGF蛋白的表達(N:對照組,K:模型組)

        3 討論

        1988年Almendral等[2]首先發(fā)現(xiàn)小鼠CTGF。1991年Bradham等[3]用親和色譜法在人臍靜脈內(nèi)皮細胞的條件培養(yǎng)基中首次發(fā)現(xiàn)人CTGF,隨后發(fā)現(xiàn)CTGF廣泛存在于人的腎、肺、胰腺、動脈、肝、心和腦等多種組織器官中,成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞及某些癌細胞均可表達CTGF[4]。

        近幾年,國內(nèi)外一些學者從分子水平研究了梗阻性腎病的改變,制作了輸尿管完全及部分梗阻的動物模型。研究表明腎萎縮及腎間質(zhì)纖維化與一些細胞因子表達改變有關(guān),研究主要集中在表皮生長因子(EGF)[5]、TGF-β[6]等,CTGF為TGF-β1致纖維化作用的下游關(guān)鍵性效應(yīng)因子,是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞因子,其發(fā)現(xiàn)為進一步研究腎臟纖維化的研究提供了新方向。

        前期通過臨床實驗對比研究UPJO引發(fā)腎積水患兒的患腎標本與正常腎組織標本,應(yīng)用HE染色觀察其形態(tài)學特征,免疫組織化學染色法、免疫電鏡檢測其CTGF的表達和分布差性,結(jié)果顯示對照組腎臟各部位無明顯病理改變;觀察組腎實質(zhì)見腎小球數(shù)目和面積減少、腎小管間質(zhì)纖維化明顯、呈灶狀分布,腎盂及腎盂輸尿管連接處的移行上皮細胞被擠壓變形[7];CTGF在患腎的腎實質(zhì)、腎盂、腎盂輸尿管連接處狹窄段中的表達明顯增高[8]。

        本實驗采用輸尿管結(jié)扎并剪斷法制作腎積水模型,分別取術(shù)后1、2、4、8周4個時間點,觀察其病理變化。結(jié)果顯示CTGF在模型組中結(jié)扎側(cè)腎臟各時間點均有陽性表達,主要分布于腎小管上皮細胞胞質(zhì)及增生的腎間質(zhì)細胞中,并且隨著梗阻時間延長,CTGF陽性細胞數(shù)逐漸增多,表達增強。Western blot法顯示,隨梗阻病情進展,CTGF蛋白表達量增高,且差異有統(tǒng)計學意義,術(shù)后4周及8周的數(shù)值與前期研究CTGF在先天性腎積水患兒中表達結(jié)果相一致。由此,可在此模型上行腎積水CTGF的研究并行后續(xù)藥物療效觀察等實驗。

        [1]AlmendralJ M,Sommer D,Macdonald-Bravo H,et al.Complexity of the early genetic response to growth factor in mouse fibroblass [J].MolCellBiol,1988,8(5):2140-2148.

        [2]Bradham D M,Igarshi A,Potter R L,et al.Connective tissue growth factor:a cystine-rich mitogen secreted by human vascular endothelial cell is related to the SRC-induced immediate early gene product CEF-10[J].J CellBiol,1991,114(6):1285-1294.

        [3]Chaqour B,Goppelt-Struebe M.Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins[J].PEBS J,2006,273(16): 3639-3649.

        [4]Yang Y,Hou Y,Wang C L,et al.Renal expression of epidermal growth factor and transforming growth factor-betal in children with congenital hydronephrosis[J].Jiurology,2006,67(4):817-822.

        [5]楊屹,吉士俊,趙國貴,等.轉(zhuǎn)化生長因子在先天性腎積水中的表達研究[J].中華泌尿外科雜志,2001,10(22):604-606.

        [6]曹廣信,劉永東,李俊峰,等.先天性腎積水組織的超微結(jié)構(gòu)及CTGF表達定位的電鏡觀察[J].中國醫(yī)師雜志,2016,18(9):1393-1395.

        [7]曹廣信,李俊峰,張廣平,等.結(jié)締組織生長因子在UPJO引發(fā)腎積水兒童患者腎組織中的表達[J].貴州醫(yī)科大學學報,2016,41(10):1224-1230.

        [8]閔亞麗,藍天座.單側(cè)輸尿管結(jié)扎致大鼠腎間質(zhì)纖維化模型中CTGF、a-SMA的動態(tài)觀察[J].貴陽醫(yī)學院學報,2006,31(3):251-256.

        Expression of CTGF in kidney tissue of rat hydronephrosis model

        LIU Yongdong,HAN Jianqiang,ZHANG Guangping,et al. Department of Urology,Weifang People's Hospital,Weifang 261041,China

        ObjectiveTo investigate the expression of connective tissue growth factor(CTGF)in kidney tissue of rat hydronephrosis model.MethodsForty eight healthy male Wistar rats were equally divided into two groups:in model group the left pelviureteric junction was dissociated and the ureter was ligated,and in control group the left pelviureteric junction was dissociated only.Six rats in each group were sacrificed 1,2,4 and 8 weeks after the operation and the left kidney was taken for histopathologicalexamination.TheexpressionofCTGFproteinandmRNAinkidneytissuewasdetectedwith immunohistochemistry and Western blot,respectively.ResultsThe expression of CTGF mRNA and protein in model group was significantly higher than that in the control group(P<0.01)and increased with the time length of pelviureteric junction obstruction. ConclusionThe expression of CTGF is upregulated in the rat hydronephrosis model and positively correlated with the obstruction duration,indicating that CTGF might be used as a target of preventing congenital hydronephrosis.

        RatsHydronephrosisCTGF

        2016-06-26)

        (本文編輯:陳麗)

        10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2016-966

        261041山東省濰坊市人民醫(yī)院小兒外科(劉永東、韓建強、李俊峰、張傳光、胡強);山東省蘭陵縣人民醫(yī)院小兒外科(張廣平)

        胡強,E-mail:DHQ7936@163.com

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