魏雙雙 張治芬 黃哲人 何軼然 吳紅艷 劉文華 湯珊珊 黃堅

●論著

雌激素對去卵巢大鼠骨組織Wnt16、β- catenin、OPG、RANKL 表達的影響

魏雙雙 張治芬 黃哲人 何軼然 吳紅艷 劉文華 湯珊珊 黃堅

目的研究雌激素對去卵巢大鼠骨組織中Wnt16、β-catenin、OPG、RANKL表達的影響，探討雌激素對骨組織的保護作用。方法選取3月齡Wistar雌性大鼠40只，隨機分為假手術組、去勢組、實驗組1和實驗組2。兩組實驗組分別給予17β-雌二醇皮下注射4周和16周，其余兩組給予等量0.9%氯化鈉溶液。16周后測定骨組織中Wnt16、OPG、RANKL、β-catenin表達量，HE染色分析大鼠脛骨平臺處骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數目（Tb.N）和骨小梁間距（Tb.SP）變化，ELISA法測定血清雌二醇（E2）水平。結果假手術組、實驗組2與去勢組比較，OPG、β-catenin、Wnt16 mRNA、血清E2水平、Tb.Th和Tb.N明顯升高，RANKL水平和Tb.SP明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。實驗組1與去勢組相比，β-catenin、血清E2水平、Tb.Th和Tb.N明顯升高，RANKL水平和Tb.SP明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。結論雌激素可能通過上調Wnt16、β-catenin、OPG表達，下調RANKL表達，來預防骨質疏松。

雌激素 Wnt16 β-catenin OPG RANKL 骨質疏松

骨質疏松分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，其中原發(fā)性骨質疏松以絕經后骨質疏松（postmenopausal osteoporosis, PMO）最常見[1-3]，這可能與絕經后雌激素減少有關[4-5]?；A和臨床研究均證實雌激素的骨保護作用，但其作用機制仍不明確[6-7]。近年來隨著Wnt/β-鏈蛋白（βcatenin）信號途徑的發(fā)現(xiàn)，對其調節(jié)作用的研究也受到關注，研究表明Wnt1突變引起成骨不全癥[8]；成骨細胞高表達Wnt7b可促進骨量的增加[9]，高表達Wnt4可在一定程度上緩解卵巢切除誘導的骨質流失[10]。Wnt16屬于Wnt家族，可通過Wnt/β-catenin信號途徑，參與調控人類骨骼系統(tǒng)疾病，與骨密度、骨皮質厚度、骨強度、骨折發(fā)生風險有關[11]。本實驗利用去卵巢大鼠，探討雌激素通過調節(jié)Wnt16/β-catenin信號途徑預防骨質疏松的可能作用機制。Henry等[11]提出雌激素的骨保護作用機制可能與骨保護素（OPG）/NF-κB活化受體(RANK)/ NF-κB活化受體配體（RANKL）系統(tǒng)有關，Wnt16/βcatenin信號途徑可調控OPG的表達，故本實驗又對OPG、RANKL進行檢測，試圖進一步探討雌激素的保護機制，為雌激素防治PMO提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑雌二醇試劑（美國Sigma公司）；大鼠雌二醇免疫吸附測定(ELISA)試劑盒ESBL4287(美國EVER公司)；總RNA提取試劑盒（TRIzol）（美國Invitrogen Life Technologies公司）；Wnt16引物（武漢谷歌生物科技有限公司合成）；一抗RANKL（美國Santa Cruz公司）；一抗β-catenin、一抗OPG（美國abcam公司)；HRP標記山羊抗兔鼠通用二抗、組化試劑盒DAB顯色劑（丹麥DAKO公司）。

1.2 實驗動物選取SPF級3月齡Wistar雌性大鼠40只，體質量180～200g，由浙江省中醫(yī)藥大學動物中心提供。Wistar雌性大鼠飼養(yǎng)于屏障動物室，室溫（23±1）℃，濕度（50±10）%，自由進水，普通飼料喂養(yǎng)，5只/籠。

1.3 實驗分組3月齡雌性大鼠隨機分為4組，分別為假手術組、去勢組、實驗組1和實驗組2，每組10只。去勢組和兩組實驗組在喂養(yǎng)1周后切除雙側卵巢組織，假手術組切除等質量的腹部脂肪組織。術后2周兩組實驗組給予頸背部皮下注射17β-雌二醇（17β-E2）100mg/kg，其余兩組給予等量0.9%氯化鈉溶液，1次/d。實驗組1給藥4周，實驗組2給藥16周。

1.4 方法

1.4.1 取材大鼠稱質量后給予10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，經3 500r/min離心10min，分離血清，置-80℃冰箱保存。采血后，打開胸腔暴露心臟，將灌注針經左心室插入升主動脈，剪開右心房，用0.9%氯化鈉溶液灌注。剝離出大鼠雙側股骨、脛骨，天平稱其質量，一側股骨、脛骨置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，另一側股骨、脛骨采?%多聚甲醛固定。

1.4.2 組織學觀察將各組已固定的脛骨標本脫水脫鈣、包埋，制成蠟塊，連續(xù)切片，厚度約為5μm，HE染色。光鏡下隨機選取脛骨平臺骨皮質區(qū)域，20倍高倍鏡視野下觀察骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數目（Tb.N）、骨小梁間距（Tb.SP）。

1.4.3 免疫組化方法檢測大鼠脛骨骨皮質區(qū)RANKL、OPG、β-catenin表達水平取各組大鼠脛骨平臺區(qū)骨皮質標本，石蠟切片脫蠟至水后置于胰酶抗原修復緩沖液（0.1%）的修復盒中修復抗原20min，分別滴加相應一抗（抗RANKL、抗OPG、抗β-catenin，1∶100），4℃孵育切片，過夜。然后滴加HRP標記山羊抗兔鼠通用二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。DAB顯色，常規(guī)脫水、封片、顯微鏡鏡檢和照相，觀察并比較各組棕黃色顆粒的陽性細胞表達情況。

1.4.4 Western blot法檢測大鼠脛骨骨皮質區(qū)RANKL、OPG、β-catenin表達水平取各組大鼠脛骨平臺區(qū)骨皮質標本，用不連續(xù)丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白后轉膜固定，用5%脫脂牛奶封閉1h，加一抗（抗RANKL、抗OPG、抗β-catenin，1∶1 000）后4℃孵育搖晃過夜，TBST沖洗孵育二抗（1∶3 000）后，曝光顯色。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參。用圖像分析軟件曝光后，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.4.5 RT-PCR法測定大鼠脛骨骨皮質區(qū)Wnt16表達水平取各組大鼠脛骨平臺區(qū)骨皮質標本，采用總RNA提取試劑盒提取骨組織總RNA，取1μg RNA進行隨機引物逆轉錄反應得cDNA，用Wnt16特異性引物進行PCR反應，引物正鏈：AGAGGTGGAACTGTATGGTCGC，負鏈：AATGAATGCTGTCTCCTTGGTG。PCR反應：95℃預變性5min，94℃變性1min，60℃復性1min，72℃延伸1min。同時加入內參GAPDH，正鏈：TTCCTACCCCCAATGTATCCG，負鏈：CATGAGGTCCACCACCCTGTT。取PCR產物10μl電泳，計算每一樣品和其內參對照的相對含量。

1.4.6 血清E2水平測定采用ELISA法測定各組大鼠血清E2水平，使用大鼠雌二醇免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，操作按說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Tamhane′s檢驗。

2 結果

2.1 各組骨組織形態(tài)學比較去勢組與假手術組、實驗組1、實驗組2比較，Tb.N減少且排列疏、Tb.Th變薄且Tb.SP增寬（均P＜0.05），骨髓環(huán)境中脂肪細胞數量增多，見表1和圖1。

表1 各組骨組織形態(tài)學分析

圖1 各組骨組織形態(tài)（a：假手術組；b：去勢組；c：實驗組1；d：實驗組2）

2.2 各組骨組織OPG、RANKL、β-catenin免疫組化檢測結果比較骨組織OPG、β-catenin陽性細胞在假手術組最多，實驗組2次之，實驗組1較少，去勢組最少；骨組織RANKL陽性細胞在假手術組最少，實驗組2次之，實驗組1較多，去勢組最多，見圖2。

圖2 免疫組化檢測OPG、RANKL、β-catenin蛋白表達結果（×200）

2.3 各組骨組織OPG、RANKL、β-catenin Western blot檢測結果比較假手術組、實驗組2與去勢組比較，OPG、β-catenin水平均升高，RANKL水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。實驗組1與去勢組比較，β-catenin水平升高，RANKL水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。實驗組1和實驗組2與假手術組比較，OPG水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2和圖3。

2.4 各組骨組織Wnt16 mRNA及血清E2表達水平比較假手術組、實驗組2與去勢組比較，Wnt16 mRNA和血清E2水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。實驗組1與去勢組比較，血清E2水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗組2與假手術組比較，Wnt16 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3和圖4。

3 討論

Wnt家族是富含分泌型半胱氨酸的糖蛋白，根據是否依賴β-catenin轉導，分為經典型和非經典型[12-13]。Wnt16屬于Wnt家族，具有高度保守性，通過Wnt/βcatenin信號途徑，參與調控人類骨骼系統(tǒng)疾病[11]。Wnt16與配體結合后，通過活化低密度脂蛋白受體相關蛋白/卷曲蛋白受體，使β-catenin從β-catenin/糖原合酶激酶3β復合體中解離，引起β-catenin在胞質中累積[14-15]。β-catenin表達量增加時，引起成骨細胞相關基因表達活躍，促進骨形成；β-catenin基因失活時，導致間充質細胞向軟骨細胞分化而不是向成骨細胞分化[16-17]。因此，本研究采用去卵巢Wistar雌性大鼠，利用免疫組化、Western blot、RT-PCR法從蛋白質、mRNA水平探討雌激素發(fā)揮骨保護的可能作用機制，結果發(fā)現(xiàn)切除大鼠雙側卵巢引起雌激素缺乏導致Wnt16 mRNA、β-catenin表達減少，Tb.N減小且排列稀疏、Tb.Th變薄且Tb.SP增寬，最終導致骨質疏松[18]。給予外源性雌激素16周后，Wnt16 mRNA表達量升高[11]，提示Wnt16的表達可能很大程度上依賴雌激素的作用，其具體調節(jié)機制尚不明確。目前認為可能機制是，Wnt16啟動子上含有功能性c-Jun結合位點[19]，雌激素直接和/或間接作用于Wnt16啟動子，調控Wnt16的表達，激活Wnt16/βcatenin信號途徑，進而促進成骨細胞相關基因表達，發(fā)揮骨保護作用。此外，雌激素治療，可緩解因雌激素缺乏導致的骨髓環(huán)境中脂肪細胞的增多。Gao等[16]研究表明，17β-E2呈劑量依賴性，通過Wnt/β-catenin信號途徑抑制骨髓間充質干細胞向脂肪細胞分化。在鼠3T3-L1脂肪前體細胞中，β-catenin通過減少CCAAT/增強子結合蛋白-α和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的表達[20]，抑制其分化為脂肪細胞。敲除β-catenin基因，可增加PPARγ表達，促進骨髓環(huán)境的脂肪形成[21]。因此，雌激素可能通過Wnt/β-catenin信號途徑抑制脂肪細胞形成，從而發(fā)揮骨保護作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，E2處理4周時，β-catenin即可增加，而Wnt16僅在16周時出現(xiàn)差異，這表明可能存在其他Wnt/β-catenin途徑參與雌激素調節(jié)的過程。馬威等[22]研究也證實，雌激素可以促進Wnt2、β-catenin蛋白表達，通過調節(jié)Wnt2/βcatenin信號途徑促進去卵巢后骨質疏松大鼠成骨細胞增殖，這可能是引起Wnt16與β-catenin非同步變化的原因。

表2 各組骨組織OPG、RANKL、β-catenin表達水平比較

圖3 各組骨組織OPG、RANKL、β-catenin蛋白的表達

表3 各組骨組織Wnt16 mRNA及血清E2表達水平比較

圖4 骨組織Wnt16 mRNA擴增曲線

RANKL是表達在成骨細胞和基質細胞上的膜結合蛋白，可被金屬蛋白酶分解為可溶性RANKL，通過與RANK特異受體結合后活化成熟破骨細胞，最終引起骨質吸收[23]。OPG是成骨細胞和骨髓基質細胞分泌的可溶性誘導受體，通過與RANK競爭性結合RANKL，阻斷RANK/RANKL信號通路，抑制成熟破骨細胞的骨吸收活性[4,23]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予雌激素16周后，促進OPG表達、抑制RANKL表達，進而增加OPG/RANKL比率，對去卵巢大鼠骨質疏松有明顯的防治作用。因此，雌激素可能通過OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)發(fā)揮骨保護作用。

Movérare-Skrtic等[24]研究表明，成骨細胞來源的Wnt16可增加OPG表達，間接抑制破骨細胞分化，也可作用于破骨祖細胞，直接抑制破骨細胞生成；特異性敲除成骨細胞Wnt16基因，可導致OPG表達減少，破骨細胞數量增多，骨皮質變薄，使骨折發(fā)生風險增加。結合本研究，E2處理16周后，Wnt16、β-catenin、OPG表達增加。因此，雌激素可能作用Wnt16/β-β-catenin途徑后，進一步作用于OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)發(fā)揮骨保護作用，但具體機制尚不明確，仍需進一步細胞學研究。

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Effects of estrogen on Wnt16,β-catenin,OPG,RANKL expression in bone tissue of ovariectomized rats

WEI Shuangshuang, ZHANG Zhifen,HUANG Zheren,et al.Department of Obstetrics and Gynecology，Hangzhou Hospital of Nanjing Medical University, Hangzhou 310006，China

ObjectiveTo investigate the effects of estrogen on the expression of Wnt16,β-catenin,OPG,RANKL in bone tissue of ovariectomized rats.MethodsForty female Wistar rats were randomly dividedinto sham operation group, ovariectomized group,estrogen group 1 and estrogen group 2.In the estrogen groups,17β-E2was injected subcutaneously for 4 weeks or 16 weeks after ovariectomy,respectively.The other two groups were given the same volume of normal saline.The expression of Wnt16 mRNA was detected with RT-PCR,the expressions of OPG,RANKL,β-catenin proteins in bone cortex tissue were detected with Western blot and immunohistochemistry,respectively.The thickness of the trabecular bone(Tb.Th), number of trabecular bone(Tb.N)and thetrabecular spacing(Tb.SP)were measured using HE staining analysis,and serum E2level was determined by ELISA.ResultsCompared to ovariectomized group,The expression of OPG,β-catenin,Wnt16 mRNA in bone tissue,the serum E2levels,and Tb.Th,Tb.N in estrogen group 2 and sham operation group were significantly increased, the expression of RANKL and Tb.SP were significantly decreased(all P＜0.05).Compared to ovariectomized group the expression of β-catenin,serum E2,and Tb.Th,Tb.N in estrogen group 1 were significantly increased,the expression of RANKL and Tb.SP were significantly decreased(all P＜0.05).ConclusionEstrogen may prevent osteoporosis by up-regulation of Wnt16, β-catenin,OPG and down-regulation RANKL expression in bone tissue.

EstrogenWnt16β-cateninOPGRANKLOsteoporosis

2016-09-22）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2016-1489

國家衛(wèi)生計生委科學研究基金-浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生重大科技計劃（WKJ-ZJ-024）；浙江省科技廳重大科技專項重點項目（2014C03044-1）；杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃重點項目2011Z003）；杭州市科技局重點項目（20142013A58,20140733Q16）

310006南京醫(yī)科大學附屬杭州醫(yī)院婦產科（魏雙雙、張治芬、黃哲人、何軼然、吳紅艷）；杭州市婦產科醫(yī)院婦產科（劉文華、湯珊珊、黃堅）

張治芬，E-mail：zhangzf@zju.edu.cn