張雪洛，陳艷花，武學(xué)清

(山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，山西 太原 030012)

種植窗期子宮內(nèi)膜微血管密度與胚胎種植結(jié)局的相關(guān)性探討〔1〕

張雪洛，陳艷花，武學(xué)清

(山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，山西 太原 030012)

目的：探討種植窗期子宮內(nèi)膜微血管密度(MVD)對評價胚胎種植結(jié)局的價值。方法：選擇行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療的患者60 例，根據(jù)新鮮周期是否妊娠分為臨床妊娠組(30 例)及未妊娠組(30 例)。全部患者均于行IVF-ET前一個月經(jīng)周期排卵后的第7天用一次性宮腔組織吸引管獲取子宮內(nèi)膜組織，采用免疫組化的方法進(jìn)行MVD測定。結(jié)果：臨床妊娠組MVD高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。未妊娠組HCG日孕酮高于臨床妊娠組，臨床妊娠組三線型子宮內(nèi)膜比例高于未妊娠組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：HCG日孕酮提前升高，導(dǎo)致妊娠率下降。種植窗期子宮內(nèi)膜微血管密度對預(yù)測妊娠結(jié)局有一定的臨床意義。

體外受精-胚胎移植；子宮內(nèi)膜；微血管密度；妊娠結(jié)局

近年來，輔助生殖技術(shù)的發(fā)展為眾多不孕患者解決了生育難題，但仍有部分患者出現(xiàn)反復(fù)的妊娠丟失。有報道稱反復(fù)移植失敗與子宮內(nèi)膜的微環(huán)境有一定的關(guān)聯(lián)[1]，且子宮內(nèi)膜良好的血供是著床成功的必要條件。因此種植窗期子宮內(nèi)膜微血管密度成為近年來研究的熱點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年3月—2016年11月在山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療的60 例患者，年齡(30.61±4.34) 歲，具有正常的月經(jīng)周期，周期21～35 d，經(jīng)倫理委員會同意，并經(jīng)患者簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：因輸卵管因素、男性因素或不明原因的不孕接受IVF-ET助孕的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除輸卵管積水、子宮內(nèi)膜受損、卵巢反應(yīng)不良等明顯影響成功種植的因素，排除染色體、解剖、內(nèi)分泌異常及感染、自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、甲狀腺疾病、紅斑狼瘡等。根據(jù)隨訪IVF-ET結(jié)局是否臨床妊娠分成未妊娠組和臨床妊娠組。

所有患者均采用常規(guī)黃體中期長方案，即排卵后7 d(黃體中期)給予醋酸亮丙瑞林1.25 mg，達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后給予促排卵，采用經(jīng)陰道超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜變化和卵泡生長情況，當(dāng)至少有2個卵泡直徑大于18 mm時，當(dāng)晚注射絨促性素1萬U，注射后36～40 h左右取卵，體外受精，于取卵后3 d，移植優(yōu)質(zhì)胚胎2枚，移植后28 d經(jīng)陰道B超見到孕囊為臨床妊娠，未看見妊囊或生化妊娠者歸為未妊娠組。

1.2 標(biāo)本收集

所有患者均在IVF-ET前一個自然周期的第8天至第10天行陰道超聲連續(xù)監(jiān)測卵泡發(fā)育，若超聲下可見卵泡已排，測定黃體生成素及孕酮，根據(jù)激素水平確定為排卵。則于排卵后7 d用一次性宮腔組織吸引管取少許內(nèi)膜組織，于10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋制片。

1.3 試劑

鼠抗人CD34一抗和二抗(北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn))；立可靈一次性宮腔組織吸引管(C3.1/30-1S型，上海家寶醫(yī)學(xué)保健科技有限公司)；超聲儀(ALOKA公司SSD-4000型)。

1.4 方法

切片；烤片，60 ℃1h；脫蠟至水；蒸餾水洗3 min；pH 6.0檸檬酸鹽修復(fù)液微波爐加熱至沸騰，持續(xù)加熱20 min，室溫冷卻20 min；蒸餾水洗3 min；3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶，室溫10min；pH7.4 0.01 mol/L PBS沖洗5 min×2次；一抗室溫孵育1 h；PBS沖洗5 min×3次；Dako REALTM EnVisionTM二抗孵育孵育30 min；PBS沖洗5 min×3 次；DAB顯色，5～10 min；蘇木素復(fù)染1 min，鹽酸酒精分化5 s，自來水返藍(lán)1 min；脫水、透明、封片。以PBS代替一抗為陰性對照。

1.5 微血管密度(MVD)測定方法

子宮內(nèi)膜MVD測定參照Weildner等[2]微血管密度計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：對經(jīng)CD34單克隆抗體免疫組化處理的切片在Olympus(BX51)正置顯微鏡下觀察，先在低倍鏡下(100 倍)掃描整個視野，選擇內(nèi)皮細(xì)胞染色棕黃色最密集的3 個區(qū)域即微血管形成豐富區(qū)域，然后轉(zhuǎn)至高倍鏡下(400倍)拍攝5個視野，計數(shù)每個視野血管數(shù)量，相加求得算術(shù)平均數(shù)，此平均數(shù)代表每張切片中子宮內(nèi)膜組織微血管密度定量數(shù)，即為每高倍視野的血管數(shù)。任何一個胞質(zhì)呈棕染的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，與周圍其他組織有明顯界限，無論有無血管腔、無論管腔內(nèi)有無紅細(xì)胞均定義為一個微血管，管腔大于8個紅細(xì)胞直徑或有明顯肌層者不計數(shù)在內(nèi)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般情況比較

兩組患者的年齡、不孕年限、不孕類型、基礎(chǔ)促卵泡激素(FSH)、基礎(chǔ)促黃體激素(LH)、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)等一般情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 兩組患者一般情況分析

2.2 兩組臨床資料比較

兩組患者臨床資料比較發(fā)現(xiàn)，在Gn啟動量，用藥天數(shù)，人絨毛膜促性腺激素(HCG)日雌二醇(E2)、LH、內(nèi)膜厚度、類型，獲卵數(shù)，MII卵率，受精率，優(yōu)質(zhì)胚胎率等方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。但未妊娠組HCG日孕酮(P)明顯高于臨床妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。且臨床妊娠組移植日三線型內(nèi)膜例數(shù)明顯高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 兩組患者臨床數(shù)據(jù)分析

2.3 兩組子宮內(nèi)膜MVD比較

CD34標(biāo)記的子宮內(nèi)膜MVD結(jié)果見圖1～圖4(圖1和圖2為未妊娠組，圖3和圖4為臨床妊娠組)。臨床妊娠組MVD為(12.3±4.5)條/HP，未妊娠組為(9.1±0.9)條/HP，臨床妊娠組MVD高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

目前認(rèn)為影響IVF-ET結(jié)局的主要因素有胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜容受性(ER)和胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜的同步化。子宮內(nèi)膜容受性[3]是指子宮內(nèi)膜允許胚胎定位、黏附、穿透，并誘導(dǎo)間質(zhì)發(fā)生改變，從而允許胚胎著床的狀態(tài)。評價子宮內(nèi)膜容受性最準(zhǔn)確的方法是內(nèi)膜活組織檢查。但常規(guī)的子宮內(nèi)膜活組織檢查方法對內(nèi)膜損失較大，本實(shí)驗(yàn)中使用一次性宮腔組織吸引管吸取內(nèi)膜組織，這種方法具有安全、有效、創(chuàng)傷小、操作簡單、出血量少等優(yōu)點(diǎn)，并且可以實(shí)現(xiàn)預(yù)移植的目的。

圖1 CD34標(biāo)記的未妊娠組子宮內(nèi)膜微血管(SP×100)

圖2 CD34標(biāo)記的未妊娠組子宮內(nèi)膜微血管(SP×400)

圖3 CD34標(biāo)記的妊娠組子宮內(nèi)膜微血管(SP×100)

圖4 CD34標(biāo)記的妊娠組子宮內(nèi)膜微血管(SP×400)

子宮內(nèi)膜良好的血供是評價內(nèi)膜容受性的重要方面[4]。MVD是目前公認(rèn)的評價血管活躍程度的指標(biāo)[5]。MVD越高說明新生血管越豐富。而人類白細(xì)胞抗原CD34是一種小血管相關(guān)的抗原，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，其靈敏度及特異度較高。本研究中妊娠組MVD明顯高于未妊娠組，說明妊娠組子宮內(nèi)膜的血管生成豐富，有較豐富的血液供應(yīng)，為胚胎的成功著床提供充足的營養(yǎng)，提高了子宮內(nèi)膜的容受性。有研究證實(shí)，同樣以CD34為標(biāo)記物，子宮內(nèi)膜癌中的MVD顯著高于正常子宮內(nèi)膜[6]，并認(rèn)為豐富的血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件。因此對于因子宮內(nèi)膜血管生成不良而導(dǎo)致妊娠率下降患者可以考慮使用促血管生成因子來改善血管生成情況，豐富內(nèi)膜的血供，從而提高妊娠率。

胚胎發(fā)育和子宮內(nèi)膜的同步化也是成功妊娠的必要因素。一項(xiàng)大樣本研究發(fā)現(xiàn)[7]，卵巢功能正常人群，HCG日孕酮大于1.75 ng/mL，持續(xù)率呈下降趨勢?？紤]孕酮的提前升高，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜和胚胎發(fā)育不同步，內(nèi)膜對胚胎的容受性下降，最終妊娠失敗。本研究發(fā)現(xiàn)，HCG日未妊娠組孕酮明顯高于妊娠組，推測孕酮的提前升高可能是患者最終流產(chǎn)的高危因素。Melo等[8]對贈卵周期的自身對照研究顯示孕酮升高不影響卵子及胚胎質(zhì)量。本研究中兩組患者的MII卵率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明孕酮的升高對卵子及胚胎質(zhì)量影響不大。

目前對于內(nèi)膜的形態(tài)與IVF-ET妊娠率的關(guān)系存在廣泛爭議，且內(nèi)膜形態(tài)的評判受監(jiān)測者主觀評判性影響較大，但大部分學(xué)者仍認(rèn)為三線型子宮內(nèi)膜的妊娠率偏高。李素春等[9]發(fā)現(xiàn)，種植窗口期宮腔鏡下子宮內(nèi)膜的形態(tài)能較好地預(yù)測妊娠率及妊娠結(jié)局。葛明曉等[10]認(rèn)為，促排卵周期的月經(jīng)第1天至第2天行子宮內(nèi)膜搔刮術(shù)能改善子宮內(nèi)膜的形態(tài)，顯著提高妊娠率。雖然本研究結(jié)果也顯示三線型子宮內(nèi)膜妊娠率較非三線型子宮內(nèi)膜偏高，但由于樣本量較少，有待于進(jìn)一步證實(shí)。

本研究通過對比臨床妊娠組和未妊娠組的子宮內(nèi)膜微血管密度證實(shí)，子宮內(nèi)膜豐富的血供有利于妊娠率的提高。但由于樣本量有限，對此結(jié)論的說服力欠佳。且本實(shí)驗(yàn)缺少陰道超聲下子宮內(nèi)膜血流參數(shù)的測定，有待于進(jìn)一步的研究。

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Relationship between microvessl density and vitro fertilization treatment outcome in the window endometrium of implantation

ZHANG Xueluo，CHEN Yanhua，WU Xueqing

(Reproductive Medicine Center of Shanxi Maternal and Child Health Hospital，Taiyuan 030012，China)

Objective：To evaluate the value of endometrial microvessel density (MVD) in assessing in vitro fertilization(IVF) treatment outcome during the window endometrium of implantation.Methods：A total of 60 patients undergoing in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET) treatment were analyzed retrospectively.The subjects were divided into clinical pregnancy group (30 cases) and nonpregnant group (30 cases) according to the IVF-ET outcome.Endometrial tissues were collected 7～9 days after the natural ovulation prior to IVF-ET for measurement of the endometrial MVD.Results：The endometrial MVD was significantly higher in the clinical pregnancy group than in the nonpregnant group.The progesterone was significantly higher in the nonpregnant group than in the clinical pregnancy group while the proportion of triple-line pattern endometrial was significantly higher in the clinical pregnancy group than in the nonpregnant group.Conclusion：The progesterone elevation on the day of HCG is negatively related to the pregnancy rate.The endometrial MVD in the window endometrium of implantation has clinical significance in forecast the IVF treatment outcome.

in vitro fertilization embryo transfer；endometrium；microvessl density；the IVF treatment outcome

1671-8631(2017)03-0166-04

〔1〕本課題為山西省婦幼保健院院內(nèi)課題(項(xiàng)目編號：0102214001)

R717

A

2016-11-23

(本文編輯：王作利)

張雪洛(1987— )，女，黑龍江省綏化市人，碩士學(xué)位，住院醫(yī)師。研究方向：輔助生殖醫(yī)學(xué)。