王建吳，羅靜，郭琿

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

1，25-二羥維生素D3對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用研究〔1〕

王建吳，羅靜，郭琿*

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

目的：探討1，25-二羥維生素D3[1，25(OH)2D3]對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的作用。方法：54 只健康雄性wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、UUO組(B組)、1，25(OH)2D3治療組(C組)。每組于術(shù)后第1天、第3天、第7天分批處死6 只，留取腎臟組織。用HE染色觀察腎臟病理變化，采用免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定腎臟人叉頭框蛋白P3(FOXP3)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，UUO組FOXP3表達(dá)水平顯著降低，α-SMA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與UUO組相比，1，25(OH)2D3治療組FOXP3表達(dá)水平顯著升高，α-SMA表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生及發(fā)展；1，25(OH)2D3作為免疫調(diào)節(jié)劑可通過(guò)上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減緩腎臟纖維化的進(jìn)展。

1，25-二羥維生素D3；腎臟間質(zhì)纖維化；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟病(CKD)，包括原發(fā)性、繼發(fā)性腎小球疾病，腎小管間質(zhì)和血管疾病以及腎移植慢性排斥性病變發(fā)展至終末期腎臟病(ESRD)共同的最終結(jié)局，病理特點(diǎn)包括細(xì)胞外基質(zhì)增多、炎癥細(xì)胞在間質(zhì)沉積、腎小管擴(kuò)張或萎縮、細(xì)胞凋亡等，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前治療效果不理想。炎癥是慢性腎臟疾病的基本病理改變，也是腎纖維化的啟動(dòng)因素，主要表現(xiàn)為免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和分泌炎性介質(zhì)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一種免疫細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)特異性的表達(dá)人叉頭框蛋白P3(FOXP3)轉(zhuǎn)錄因子[1]，因此FOXP3在一定程度上可反映Treg細(xì)胞的水平和活性。多項(xiàng)研究證實(shí)，Treg細(xì)胞紊亂參與了肝臟及肺臟纖維化的進(jìn)展[2-4]。Treg細(xì)胞是否參與腎臟間質(zhì)纖維化的發(fā)生及發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究較少。

1，25-二羥維生素D3是維生素D3的活性形式，通過(guò)與特異性維生素D受體(VDR)結(jié)合而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。維生素D受體主要存在于T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中[6]，1，25-二羥維生素D3主要參與耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞成熟、Treg細(xì)胞的分化及促進(jìn)免疫抑制反應(yīng)的細(xì)胞因子的分泌進(jìn)而抑制反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答[7]。1，25-二羥維生素D3是否通過(guò)上調(diào)Treg細(xì)胞減緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外研究較少。本研究主要探討單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型中Treg細(xì)胞的變化及1，25-二羥維生素D3對(duì)其的影響，從而闡述1，25-二羥維生素D3是否可通過(guò)上調(diào)Treg細(xì)胞減緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 研究的主要試劑和儀器

叉頭蛋白P3抗體(北京博奧森公司)、抗α-SMA抗體(Abcam公司)、羊抗兔IgG抗體(北京博奧森公司)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(北京博奧森公司)、DAB顯色液(北京中杉金橋公司)、1，25(OH)2D3(羅蓋全，上海羅氏公司)、熒光顯微鏡(Nikon公司)。

1.2 研究對(duì)象及分組

健康清潔級(jí)wistar大鼠54 只，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重為190～210 g，平均(200±10) g。將所有wistar大鼠隨機(jī)分成3 組，分別為假手術(shù)組(A組)、UUO組(B組)、1，25(OH)2D3治療組(C組)，每組各18 只，三組均于術(shù)后第1天、第3天、第7天分批處死6 只，留取手術(shù)側(cè)的腎組織。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 UUO模型制備

將B組及C組健康雄性wistar大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)經(jīng)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪毛并消毒腹部皮膚，行左側(cè)恥骨上切口，逐層切開(kāi)皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露并分離左側(cè)輸尿管，沿左腎下極尋找到左輸尿管，于中上1/3處用4號(hào)線上下結(jié)扎兩處，然后從中剪斷輸尿管。A組大鼠輸尿管不予結(jié)扎，麻醉及其余手術(shù)步驟同UUO模型組。

1.3.2 給藥劑量

C組給予1，25(OH)2D33 ng/100 g，A組及B組給予花生油0.5 mL，均于每日上午灌胃，實(shí)驗(yàn)期間各組正常飲食生活。

1.3.3 組織標(biāo)本灌注及取材

用濃度為10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后，打開(kāi)胸腔，將灌注用針經(jīng)心尖部進(jìn)入左心室，然后剪開(kāi)右心耳，迅速推入生理鹽水，心耳處流出無(wú)色澄清液體后停止灌注。剪開(kāi)腹腔，取出手術(shù)側(cè)腎臟組織。

1.3.4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察

常規(guī)石蠟切片，HE染色，觀察腎臟組織改變。

1.3.5 腎臟組織FOXP3蛋白、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的檢測(cè)

取腎組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)。4 μm厚石蠟切片脫蠟水化后，用體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氫溶液處理內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，微波修復(fù)(EDTA緩沖液)，3%BSA封閉液封閉40 min，分別滴加FOXP3抗體(稀釋300倍)、抗α-SMA抗體(稀釋200倍)，37 ℃孵化2 h。PBS緩沖液清洗3次，每次5 min，加入二抗(稀釋200倍)，37 ℃孵化30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。以FOXP3蛋白在腎小管上皮細(xì)胞染成黃色或棕黃色為陽(yáng)性。采用熒光顯微鏡(200倍)觀察采集圖像。每個(gè)切片隨機(jī)測(cè)定5個(gè)視野，應(yīng)用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測(cè)量每一視野中陽(yáng)性染色區(qū)域的積分光密度值(IOD)與測(cè)量區(qū)域的面積(Area)，計(jì)算平均光密度，平均光密度=IOD/Area，對(duì)免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 腎組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

光鏡下觀察，HE染色A組未見(jiàn)明顯異常。B組術(shù)后第1天和第3天腎小管輕度擴(kuò)張，上皮細(xì)胞空泡變性，腎間質(zhì)寬度增加，間質(zhì)中少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；第7天腎小管擴(kuò)張明顯，上皮細(xì)胞出現(xiàn)變性、水腫、甚至壞死，腎間質(zhì)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)寬度明顯增加，偶見(jiàn)萎縮腎小管，纖維化較明顯，表明UUO模型造模成功。

2.2 各組大鼠腎組織α-SMA、FOXP3表達(dá)情況比較

與A組比較，B組腎組織α-SMA表達(dá)水平顯著升高，F(xiàn)OXP3表達(dá)水平顯著降低，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)OXP3表達(dá)水平顯著降低，α-SMA表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組比較，C組腎組織α-SMA表達(dá)水平顯著降低，F(xiàn)OXP3表達(dá)水平顯著升高，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1、表2)。

表1 各組大鼠腎組織中α-SMA表達(dá)量

表2 各組大鼠腎組織中FOXP3表達(dá)量

3 討 論

慢性腎臟病是各種原因引起的腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙，近年來(lái)慢性腎臟病的患病率有明顯上升趨勢(shì)，每年達(dá)7%以上[8]。腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎衰竭的最終共同通路，且腎間質(zhì)纖維化程度與腎功能減退關(guān)系較密切。單側(cè)輸尿管梗阻模型是以進(jìn)行性腎小管間質(zhì)纖維化為特征的實(shí)驗(yàn)性腎臟病模型，是公認(rèn)的腎小管間質(zhì)纖維化模型。在多種細(xì)胞因子作用下，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞大量增殖并活化為肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)(如FN、各型膠原)，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白[9]。尚無(wú)有效方法抑制腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

研究表明，Treg細(xì)胞具有介導(dǎo)自身免疫耐受與維持免疫平衡，對(duì)自身反應(yīng)T淋巴細(xì)胞活化和增值起負(fù)調(diào)控作用。Treg細(xì)胞的功能失調(diào)與自身免疫性疾病、炎癥反應(yīng)、急性及慢性傳染性疾病、腫瘤免疫耐受、移植排斥以及過(guò)敏性疾病密切相關(guān)[10-11]。Claassen等[2]研究揭示，在丙型肝炎病毒造成的肝纖維化中，Treg細(xì)胞的數(shù)量越多，肝纖維化的程度越輕，提示Treg細(xì)胞可抑制肝纖維化的發(fā)展。Kotsianidis等[3-4]研究表明，通過(guò)上調(diào)大鼠Treg細(xì)胞，可抑制肺纖維化的進(jìn)展。我們的研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，UUO組腎組織FOXP3表達(dá)減少，α-SMA表達(dá)增加；隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，UUO組內(nèi)腎組織FOXP3表達(dá)減少，α-SMA表達(dá)增加，提示腎間質(zhì)纖維化中存在Treg細(xì)胞的紊亂，其減少可能加重腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

1，25-二羥維生素D3是維生素D3的活性形式，通過(guò)與單核細(xì)胞，活化的T、B細(xì)胞上的維生素D受體特異性結(jié)合而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5-6]。Jeffery等[12]研究證實(shí)，1，25-二羥維生素D3可誘導(dǎo)Foxp3高表達(dá)。Taal和Brenner[13]證實(shí)慢性腎臟病中1，25-二羥維生素D3水平下降，誘導(dǎo)RAS系統(tǒng)激活，進(jìn)而加重腎臟纖維化。本研究結(jié)果顯示：與UUO組相比，1，25-二羥維生素D3治療組腎組織FOXP3表達(dá)增加，α-SMA表達(dá)減少，提示1，25-二羥維生素D3可通過(guò)上調(diào)Treg細(xì)胞減緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，可能機(jī)制：誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞吲哚胺2，3二氧酶(IDO)的表達(dá)來(lái)上調(diào)Treg細(xì)胞的數(shù)量增加[14]；誘導(dǎo)Treg細(xì)胞表達(dá)CTLA-4、IL-10、TGF-β、Foxp3及CTLA-4[15]；促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)趨化因子CCL17和CCL20而抑制歸巢因子CCL22的表達(dá)，使Treg細(xì)胞招募至病變部位[16]。

綜上所述，在UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化中存在Treg細(xì)胞的紊亂，且Treg細(xì)胞可能參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生及發(fā)展，1，25-二羥維生素D3可能通過(guò)上調(diào)Treg細(xì)胞減緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，但對(duì)于1，25-二羥維生素D3通過(guò)何種途徑發(fā)揮上述作用，還有待進(jìn)一步研究。

[1]WING K，SAKAGUCHI S.Regulatory T cells as potential immunotherapy in allergy[J].Curr Opin Allergy Clin Immunol，2006，6(6)：482-488.

[2]CLAASSEN M A，DE KNEGT R J，TILANUS H W，et al.Abundant numbers of regulatory T cells localize to the liver of chronic hepatitis C infected patients and limit the extent of fibrosis[J].J Hepatol，2010，52(3)：315-321.

[3]KOTSIANIDIS I，NAKOU E，BOUCHLIOU I，et al.Global impairment of CD4+ CD25+ FOXP3+ regulatory T cells in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J Respir Crit Care Med，2009，179(12)：1 121-1 130.

[4]TRUJILLO G，HARTIGAN A J，HOGABOAM C M.T regulatory cells and attenuated bleomycin-induced fibrosis in lungs of CCR7-/-mice[J].Fibrogenesis Tissue Repair，2010(3)：18.

[5]MARCINKOWSKA E.A run for a membrane vitamin D receptor[J].Biol Signals Recept，2001，10 (6)：341-349.

[6]MORA J R，IWATA M，VON ANDRIAN U H.Vitamin effects on the immune system：vitamins A and D take center stage[J].Nat R Immunol，2008，8(9)：685-698.

[7]CORREALE J，YSRRAELIT M，GAITN M I.Immunomodulatory effects of vitamin D in multiple sclerosis[J].Brain，2009，132(Pt 5)：1 146-1 160.

[8]DUSSAULE J C，CHATZIANTONIOU C.Reversal of renal disease：is it enough to inhibit the action of angiotensin II[J].Cell Death Differ，2007，14(7)：1 343-1 349.

[9]王慧娟.IL-17 調(diào)節(jié) TGF-β 信號(hào)及其在腎間質(zhì)纖維化中的意義[D].南京：南京醫(yī)科大學(xué)，2013(5)：1-107.

[10]SAKAGUCHI S，YAMAGUCHI T，NOMURA T，et al.Regulatory T cells and immune tolerance[J].Cell，2008，133(5)：775-787.

[11]LITTMAN D R，RUDENSKY A Y.Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation[J].Cell，2010，140(6)：845-858.

[12]JEFFERY L E，BURKE F，MURA M，et al.1，25-Dihydroxyvitamin D3 and IL-2 combine to inhibit T cell production of inflammatory cytokines and promote development of regulatory T cells expressing CTLA-4 and FoxP3[J].J Immunol，2009，183(9)：5 458-5 467.

[13]TAAL M W，BRENNER B M.Renoprotective benefits of RAS inhibition：from ACEI to angiotensin II antagonists[J].Kidney Int，2000，57(5)：1 803-1 817.

[14]PAUST S，LU L，MECARTY N，et al.Engagement of B7 on effector T cells by regulatory cells prevents autoimmune disease [J].Proe Natl Acad Sci USA，2004，101(28)：10 398-10 403.

[15]FARIAS A S，SPAQHOL G S，BORDEAUX-REGO P，et al.Vitamin D3 induces IDO+ tolerogenic DCs and enhances Treg，reducing the severity of EAE[J].CNS Neurosci Ther，2013，19(4)：269-277.

[16]DANIEL C，SARTORY N A，ZAHN N，et al.Immune modulatory treatment of trinitrobenzene sulfonic acid colitis with calcitriol is associated with a change of a T helper (Th) 1/Th17 to a Th2 and regulatory T cell profile[J].J Pharmacol Exp Ther，2008，324(1)：23-33.

Effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3on Treg cells in UUO rats with renal interstitial fibrosis

WANG Jianwu，LUO Jing，GUO Hui

(The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective：To explore the effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3on regulatory T cells in unilateral ureteral obstruction(UUO) rats with renal interstitial fibrosis.Methods：Fifty-four Wistar rats were assigned to healthy control group(A group)，UUO group(B group)，and 1，25-dihydroxyvitamin D3treatment group(C group).After surgery for 1 day，3 days and 7 days，6 rats were selected from every group randomly，and killed to get the renal.Renal pathological changes were observed by HE staining.The level of Forkhead Box ProteinP3(Foxp3) protein and alpha smooth muscle-actin (a-SMA) were assayed by immunohistochemistry.Results：Compared with healthy control group，the level of Foxp3 protein was significantly lower，and the expression of a-SMA protein was significantly higher in UUO group (P<0.05).Compared with UUO group，the level of Foxp3 protein was significantly higher，and the expression of a-SMA protein was significantly lower in 1，25-dihydroxyvitamin D3treatment group group (P<0.05).Conclusion：Treg cells may involve in the progress of the renal interstitial fibrosis.As an immunomodulator，1，25-dihydroxyvitamin D3might inhibit the progress of renal interstitial fibrosis through increasing the level of Treg cells.

1，25-dihydroxyvitamin D3；renal interstitial fibrosis；regulatory T cells

1671-8631(2017)03-0213-04

〔1〕本課題為山西省留學(xué)人員管理委員會(huì)辦公室科研資助項(xiàng)目(課題編號(hào)：2013-117)；山西省國(guó)際科技合作項(xiàng)目(課題編號(hào)：2013081056)

*本文通訊作者：郭琿

R692.2

A

2016-12-17

(本文編輯：張榮梅)

王建吳(1991— )，男，山東省臨清市人，在讀碩士。研究方向：腎臟病學(xué)。