黃 飛， 畢建華， 郝蘭香， 劉艷梅

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科， 江蘇 鹽城 224000)

格雷夫斯病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及尿碘的檢測(cè)及臨床意義

黃 飛， 畢建華， 郝蘭香， 劉艷梅

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科， 江蘇 鹽城 224000)

目的：探討格雷夫斯病(GD)患者外周血中的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例以及尿碘水平。方法：選取2016年4月至2016年10月我院確診但未治療的GD患者與健康受檢者各40例，以流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，以砷鈰催化分光光度法測(cè)定尿碘。結(jié)果：觀察組患者CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+CD25+T細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞中所占比例明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，尿碘檢測(cè)水平相比對(duì)照組受檢者顯著提高(P＜0.05)。結(jié)論：GD患者外周血中的CD4+CD25+ Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相比健康人群明顯減少而尿碘明顯升高，提示CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與碘可能參與GD的發(fā)生與發(fā)展。

格雷夫斯??； CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； 尿 碘

格雷夫斯病(GD，Graves Disease)是導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)癥的最常見(jiàn)致病因素，在全部甲亢患者中所占比例超過(guò)85%[1]。GD患者中將近80%體內(nèi)有抗促甲狀腺激素受體抗體(TRAB，Thyrotrophin Receptor Antibody)，在病理組織學(xué)上的典型表現(xiàn)為甲狀腺以及眼睛等效應(yīng)器官中出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。浸潤(rùn)細(xì)胞中有自身反應(yīng)性T細(xì)胞，這些T細(xì)胞與特異性損傷存在較為密切的關(guān)系[2]。CD4+CD25+Foxp3+Treg在機(jī)體內(nèi)部可以通過(guò)多種方式起到免疫抑制的功能，而近年來(lái)的研究證實(shí)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3(Foxp3，Transcription factor forkhead box p3)能夠特異性表達(dá)于CD4+CD25+Foxp3 +Treg，同時(shí)可以在發(fā)育成熟與功能表達(dá)中發(fā)揮作用[3]。本次研究主要探討GD患者外周血中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、尿碘水平與相關(guān)免疫機(jī)制的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取我院2016年4月至2016年10月我院收治的未治療GD患者40例作為觀察組，所有患者可存在突眼、甲狀腺腫大、高代謝癥候群典型甲亢癥狀或甲亢癥狀不典型，但通過(guò)血清相關(guān)檢測(cè)聯(lián)合確診，檢驗(yàn)存在血清促甲狀腺激素(TSH)水平降低，甲狀腺激素水平升高，所有患者均未服用糖皮質(zhì)激素以及非甾體類抗菌藥物。排除合并其他自身免疫性疾病的患者，排除急慢性感染、腫瘤患者，排除肝、腎、心、肺等重要臟器存在嚴(yán)重器質(zhì)性病變的患者，排除妊娠期與哺乳期患者。觀察組患者中，男12例，女28例，年齡15 至48歲，平均(24.92±6.38)歲。選取同期在我院健康體檢的40例患者作為對(duì)照組，對(duì)照組患者中，男11例，女29例，年齡17至49歲，平均(25.03±6.43)歲。兩組受檢者的性別、年齡等相關(guān)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較后發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯差異(P＞0.05)，均衡性良好。

1.2 制備方法

1.2.1 采集方法：兩組受檢者抽取3mL空腹外周靜脈血，在無(wú)菌環(huán)境下以含有0.2mL肝素鈉的真空抗凝試管完成。同時(shí)采集患者空腹晨尿10mL，在-20℃的冰箱內(nèi)保存待檢。

1.2.2 制備方法：分別配置濃度為40%與75%的Percoll分離液，恢復(fù)到室溫。在15mL的離心管中加入3mL濃度為75%的Percoll分離液，對(duì)試管壁進(jìn)行潤(rùn)濕。以注射器抽取3mL濃度為40%的Percoll分離液，沿著管壁緩慢注入，盡量保持界面分離。以1：1的比例將肝素抗凝血與磷酸鹽緩沖液混合均勻。在20℃的環(huán)境下以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度離心處理20min。在離心處理后能夠發(fā)現(xiàn)單個(gè)核細(xì)胞在兩層Percoll分離液中密集，表現(xiàn)為白膜狀，將這層細(xì)胞抽取后放入新的離心管中。加入2mL磷酸鹽緩沖液混合均勻，在4℃環(huán)境下以300G的條件離心處理10min，丟棄上部清液，并再次加入2mL緩沖液吹打均勻，以同樣的條件離心處理10min，丟棄上部清液。之后以磷酸鹽緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，將制備好的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)懸液在4℃的環(huán)境下保存。

1.2.3 染色方法：以3個(gè)流式試管分別標(biāo)記為檢測(cè)管、同型對(duì)照管、空白管，分別加入100μl調(diào)整好的PBMC懸液，在檢測(cè)管與同型對(duì)照管中加入預(yù)混的APC-CD25抗體與FITC-CD4抗體20μl，空白管不加任何抗體。在4℃且避光的環(huán)境下孵育30min。在3個(gè)試管中分別加入2mL未加熱的流式染色緩沖液，在4℃環(huán)境下以300G的速度離心處理10min，丟棄上部清液。

1.2.4 固定滲透與封閉方法：在每個(gè)試管中加入1mL固定液或者滲透液，充分混合均勻。在4℃且避光的環(huán)境下孵育45min。在每個(gè)試管中分別加入2mL配置好的1x滲透緩沖液，在4℃的環(huán)境下以300G的速度離心處理10min，丟棄上部清液后，再分別加入2mL的1x滲透緩沖液，以同樣的條件離心處理10min，再丟棄上部清液。以100μl的1x滲透緩沖液重懸細(xì)胞。在檢測(cè)管與同型對(duì)照管中分別加入正常的鼠血清2μl，混合均勻，空白管不加。在4℃的背光環(huán)境下孵育15min。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)Foxp3染色：在檢測(cè)管中加入20μl的PE-Foxp抗體，在同型對(duì)照管中加入20mL的PE-鼠IgG2a同型對(duì)照，空白管不加。在4℃的背光環(huán)境下孵育45min。每個(gè)試管中分別加入2mL的1x滲透緩沖液，在4℃的環(huán)境下以300G的速度離心處理10min，丟棄上部清液后，再分別加入2mL的1x滲透緩沖液，以同樣的條件離心處理10min，再丟棄上部清液。以300μl流式染色緩沖液重懸細(xì)胞。

1.3 檢測(cè)方法：CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞檢測(cè)方法選擇流式細(xì)胞儀檢測(cè)，在儀器初始化后以標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校正，依次檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞，圈定淋巴細(xì)胞群。以CellQuest獲取并分析數(shù)據(jù)。尿碘檢測(cè)方法選擇砷鈰催化分光光度法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本組數(shù)據(jù)采用SPSS15.0軟件包進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量指標(biāo)采用表示，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，均以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比較：兩組受檢者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見(jiàn)表1。觀察組患者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占比例與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。觀察組患者CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+CD25+T細(xì)胞中所占比例明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，CD4+ CD25+Foxp3+Treg在CD4+T細(xì)胞中所占比例明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。

表1 兩組受檢者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較(s))

表1 兩組受檢者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較(s))

組別 例數(shù)CD4+CD25+ Treg/CD4+ T細(xì)胞(%) CD4+CD25+Foxp3 +Treg/CD4+CD25 +Treg(%) CD4+CD25+Foxp3 +Treg/CD4+ T細(xì)胞(%)觀察組 40 7.59±2.28 35.68±11.29 2.48±1.06對(duì)照組 40 7.47±2.72 72.19±13.54 5.73±1.09 t 1.108 -2.934 -2.667 P 0.143 0.004 0.008

2.2 尿碘比較：兩組受檢者尿碘水平檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見(jiàn)表2。觀察組患者尿碘檢測(cè)水平相比對(duì)照組受檢者顯著提高(P＜0.05)。

表2 兩組受檢者尿碘水平檢測(cè)結(jié)果比較(s))

表2 兩組受檢者尿碘水平檢測(cè)結(jié)果比較(s))

組別 例數(shù) 尿碘(μg/L)觀察組 40 306.45±47.18對(duì)照組 40 261.39±43.62 t 1.667 P 0.028

3 討 論

GD臨床上較為常見(jiàn)，主要臨床表現(xiàn)為甲狀腺功能亢進(jìn)，部分患者伴有以眼外肌損害為主要特征的突眼癥，有的還表現(xiàn)出特殊的皮膚損害。GD病理改變主要為機(jī)體內(nèi)部大量的自身抗體，特別是針對(duì)甲狀腺細(xì)胞TSH受體的TRAb[4]。已經(jīng)能夠確定的發(fā)病因素包括體液免疫以及細(xì)胞免疫。近年來(lái)研究證實(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持機(jī)體免疫耐受中發(fā)揮重要作用，其數(shù)量的減少和功能的減弱將引起自身免疫疾病，而增加機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量則可起到緩解和治療自身免疫病的作用[5]。體外實(shí)驗(yàn)顯示，CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞能夠顯著抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖和IFN-γ的產(chǎn)生，可以多種方式影響自身免疫系統(tǒng)，從而對(duì)GD多重自身免疫病理過(guò)程產(chǎn)生影響。

Foxp3+是叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，在CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育以及成熟中作用較為明顯。CD4+CD25+Foxp3+Treg在機(jī)體中選擇性抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞以及部分效應(yīng)性T細(xì)胞，同時(shí)也是免疫系統(tǒng)自身穩(wěn)定性以及保持的重要機(jī)制[6]。在不同的內(nèi)環(huán)境因素以及疾病中，CD4+CD25+Foxp3+ Treg有不同的機(jī)制同時(shí)發(fā)揮不同的作用，包括細(xì)胞膜分子調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子抑制、轉(zhuǎn)錄因子等。本次臨床研究中，GD患者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占比例與健康人群相比無(wú)顯著差異，表明CD4 +CD25+T細(xì)胞群可能并未參與到GD的疾病發(fā)生與進(jìn)展中。而GD患者CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+ CD25+T細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞中所占比例均低于健康人群，表明CD4+CD25+Foxp3+Treg減少可能對(duì)GD疾病的發(fā)生有顯著的作用，而 Foxp3陽(yáng)性的 CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是具有免疫功能負(fù)向調(diào)節(jié)的淋巴細(xì)胞群。GD患者CD4+CD25+T細(xì)胞比例沒(méi)有明顯改變，而CD4+CD25+Foxp3+Treg明顯減少，提示具有免疫抑制活性的Foxp3+Treg缺乏與GD發(fā)病存在明顯的關(guān)系。

GD發(fā)生以及發(fā)展中碘攝入量的提高也是重要的影響因素。碘不僅是人體必需的微量元素，同時(shí)也是甲狀腺激素的主要合成原料。有研究發(fā)現(xiàn)碘含量的過(guò)度升高可能通過(guò)多種機(jī)制參與GD疾病的發(fā)生以及進(jìn)展，包括促使甲狀腺球蛋白抗原變化、誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞死亡、誘導(dǎo)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子、誘導(dǎo)人類白細(xì)胞抗原等。尿碘含量中位數(shù)是反映人群碘營(yíng)養(yǎng)狀況的關(guān)鍵指標(biāo)，在2001年ICCIDD、WHO以及UNICEF的碘攝入量標(biāo)準(zhǔn)中，健康的碘營(yíng)養(yǎng)中位數(shù)指標(biāo)為100至200μg/L。本次研究中GD患者的尿碘含量中位數(shù)為306.45μg/L，相比健康人群明顯升高，提示GD患者尿碘水平顯著升高，而碘可能是導(dǎo)致GD發(fā)病的原因之一。

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A【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.01.049

1006-6233(2017)01-0147-03

江蘇省鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目，(編號(hào)：YK212006)

劉艷梅