吳超君， 徐麗君

(吉林省人民醫(yī)院藥學(xué)部， 吉林 長(zhǎng)春 130000)

上市后眼部注射劑質(zhì)控指標(biāo)再評(píng)價(jià)

吳超君， 徐麗君

(吉林省人民醫(yī)院藥學(xué)部， 吉林 長(zhǎng)春 130000)

目的：為了提高藥品質(zhì)量，減少不良反應(yīng)，提高用藥安全性，探討已上市眼部注射制劑在質(zhì)控指標(biāo)上的差異。方法與結(jié)果：根據(jù)《中國(guó)藥典》2015版中的檢測(cè)方法，對(duì)兩種上市后的眼部注射制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室再檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在非還原性SDS-PAGE和不溶性顆粒兩個(gè)指標(biāo)上，兩種藥物存在顯示差異。非還原性SDS-PAGE檢測(cè)顯示，A藥主條帶含量86.5%，B藥63.6%；不溶性顆?！?0μm的顆粒數(shù)，A藥為0個(gè)/mL，B藥平均450個(gè)/mL；不溶性顆?！?μm，但小于≤10μm的，B藥平均值25680個(gè)/ mL，A藥2170.8個(gè)/mL。結(jié)論：兩種藥物在質(zhì)控指標(biāo)上存在差異，需要關(guān)注的是檢測(cè)結(jié)果是否對(duì)臨床療效存在潛在影響，是否影響藥品質(zhì)量及用藥的安全性，有待繼續(xù)研究。

眼部注射制劑； 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)； 療 效； 安全性

目前，生物制劑在國(guó)內(nèi)蓬勃發(fā)展，越來(lái)越多的生物制劑研發(fā)得到了市場(chǎng)準(zhǔn)許并成功應(yīng)用于臨床。我國(guó)現(xiàn)有兩種治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性疾病的生物制劑被CFDA批準(zhǔn)用于臨床，分別為雷珠單抗(A藥)和康柏西普(B藥)眼部注射劑。但是我國(guó)藥典沒(méi)有針對(duì)此類特殊部位生物制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，目的在于觀察兩藥之間質(zhì)控指標(biāo)的差異，為該類藥品的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：電泳儀，產(chǎn)地：美國(guó)Bio-Rad Laboratories，GWJ-8微粒檢測(cè)儀，產(chǎn)地：天津天大天發(fā)科技有限公司。

1.2 試藥：預(yù)制膠(BIO-RAD 7.5%)產(chǎn)地：美國(guó)Bio-Rad Laboratories。雷珠單抗 批次 S0034，產(chǎn)地：瑞士Novartis Pharma Stein AG，康柏西普 批次201507b07，產(chǎn)地：成都康弘生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法：參考《中國(guó)藥典》附錄中的相關(guān)檢測(cè)方法，對(duì)試藥進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目建立標(biāo)準(zhǔn)化流程，保證結(jié)果的可重復(fù)性。

2.1.1 非還原分子量測(cè)定(聚丙烯酰胺凝膠電泳法)：待測(cè)試藥用HPLC水稀釋至2mg/mL，然后與(4×)樣品緩沖液、HPLC水以1比1比2的比例進(jìn)行混合。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品(BIO-RAD)上樣3μl，試藥上樣后用BIO-RAD電泳儀150V電泳到溴酚藍(lán)前沿接近分離膠底部3-5mm，取出膠，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，然后在Bio-Rad ChemiDoc MP凝膠成像儀上進(jìn)行掃描，通過(guò)已知的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品分析出樣品的相對(duì)的分子量及非還原條帶的百分比。

2.1.2 檢測(cè)采用光阻法，試驗(yàn)操作環(huán)境以及所用到的微粒檢查用水均符合中國(guó)藥典的相關(guān)規(guī)定。在層流臺(tái)上稀釋樣品，加入適量新制的微粒檢查用水，使總體積不少于5mL。供檢測(cè)6次樣品，每個(gè)樣品檢測(cè)由不溶性微粒檢測(cè)儀依次測(cè)定4次，每次取樣1mL。第一次結(jié)果舍掉，取后續(xù)測(cè)定三次結(jié)果的平均值。

2.2 檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 非還原性SDS-PAGE：見(jiàn)圖1。

表1 不溶性微粒檢測(cè)指標(biāo)

圖1

圖中2、7泳道為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，泳道3為A藥加樣量10ug，泳道4為A藥加樣量5ug；泳道5為B藥加樣量10ug，泳道6為B藥加樣量5ug。圖中A藥得到主要分子表達(dá)量約40KD的分子產(chǎn)物，條帶的百分比占86. 5%，B藥獲得主要分子表達(dá)量約154KD的分子產(chǎn)物，條帶百分比占63.6%。2.2.2 不溶性顆粒：B藥不溶性顆粒的含量，≥10μm平均值426.7個(gè)/mL，而A藥為0，兩者間差異較為顯著。但B藥每瓶間顆粒含量差異較大，≥10μm的顆粒分別為45～675個(gè)/mL不等。我國(guó)藥典對(duì)≥2μm，≤10μm的顆粒數(shù)量沒(méi)有限量標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)檢測(cè)到的大于≥2μm，≤10μm的微粒，B藥平均值25680個(gè)/ mL，A藥2170.8個(gè)/mL。見(jiàn)表1。

3 討 論

3.1 為了減少人為產(chǎn)生的檢測(cè)誤差，分別由兩位研究員進(jìn)行操作，一位研究員去除藥品標(biāo)簽，改為編號(hào)A-01，A-02，A-03，A-04，A-05，A-06，B-01，B-02，B-03，B-04，B-05，B-06，另一位研究員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室操作。

3.2 非還原性SDS-PAGE是檢驗(yàn)藥品純度的指標(biāo)，與藥物雜質(zhì)、成藥性、及儲(chǔ)存條件等因素相關(guān)。說(shuō)明書中A藥為分子量 48KD的單抗藥物，B藥為分子量143KD的融合片段。本研究結(jié)果中對(duì)應(yīng)主要分子表達(dá)量的成分比例的差異，與藥物的分子量大小、藥物的糖基化水平都有關(guān)關(guān)。圖譜中B藥有一個(gè)明顯的拖尾帶，拖尾帶比例較高可能與藥物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)，從而造成分子在檢測(cè)過(guò)程中更多的解離，這對(duì)藥品臨床療效、活性、穩(wěn)定性是否有影響，還需要更多的相關(guān)臨床研究驗(yàn)證。

3.3 我國(guó)2015版藥典，在保障藥品安全、藥品質(zhì)量控制方法、技術(shù)等方面廣泛吸取國(guó)內(nèi)外先進(jìn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法，但是還存在一些差距。如USP中除了對(duì)注射劑中不溶性微粒有明確的限制外，對(duì)眼用制劑中不溶性微粒也有明確的限制規(guī)定，而我國(guó)眼用制劑不溶性微粒的標(biāo)準(zhǔn)只是參照靜脈注射劑的標(biāo)準(zhǔn)。

表2 藥典不溶微粒對(duì)比

3.4 不溶性微粒是藥品臨床應(yīng)用安全性指標(biāo)，也是藥品生產(chǎn)的質(zhì)控指標(biāo)之一，因?yàn)槠渥鳛橐环N可流動(dòng)的無(wú)法被循環(huán)代謝的外源性物質(zhì)，進(jìn)入人體后可通過(guò)刺激血管內(nèi)壁，引起靜脈血管光滑度改變，導(dǎo)致血小板黏附，從而引起靜脈炎；較大的微粒可直接造成局部循環(huán)障礙，引起血管栓塞或?qū)е氯庋磕[；微粒引起的肉芽腫脫落后隨血運(yùn)行，也可引起血管栓塞，導(dǎo)致血管堵塞、供血不足、血栓、局部組織壞死等疾病[3]。

3.5 眼部制劑作為一種特殊的局部使用藥物制劑，由于其自身的生理解剖特性，對(duì)微粒的耐受性可能更差。曾有報(bào)道隨著皮質(zhì)類固醇局部注射劑在眼科日益普及，由此治療導(dǎo)致的嚴(yán)重眼部并發(fā)癥(如視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈閉塞)事件也呈上升趨勢(shì)，分析認(rèn)為主要與皮質(zhì)類固醇顆粒堵塞視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈有關(guān)。

[1] Xu，L，et al(2013).Pharmacokinetics of Ranibizumab in Patients with Neovascular Age-Related Macular Degeneration：A Population Approach[J].Investigative Ophthalmology＆Visual Science，54(3)：1616～1624.

[2] Li，X，et al(2014).Safety and Efficacy of Conbercept in Neovascular Age-Related Macular Degeneration：Results from a 12-Month Randomized Phase 2 Study[J].AURORA Study."Ophthalmology.

[3] 韓敏，張愛(ài)琴.不溶性微粒分析在臨床注射劑質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，41(24)：1917～1918.

A【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.01.057

1006-6233(2017)01-0167-03

吉林省自然科學(xué)基金，(編號(hào)：20160101199JC)

徐麗君