瞿燕萍，高明霞，夏鵬，張婷婷，程凱，林強(qiáng)，李雪萍

脂肪組織不僅是能量儲存器官，還是重要的內(nèi)分泌器官，它可分泌多種脂肪因子和細(xì)胞因子調(diào)控全身代謝以維持機(jī)體健康[1]。由過多的脂肪組織堆積而成的肥胖可引起多種疾病，如2型糖尿病、高血壓病、血脂異常和骨代謝性疾病，后者包括骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis, OA)[2]。OA是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變，骨贅形成，滑膜炎癥及軟骨下骨硬化為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病[3]。OA是最常見的風(fēng)濕性疾病和身體殘疾的主要原因，可嚴(yán)重降低中老年人群的生活質(zhì)量，并且隨著社會人口老齡化、肥胖以及久坐等危險(xiǎn)因素的增加，OA的發(fā)病率逐年升高[4]。研究表明由脂肪組織分泌的脂肪因子作用于關(guān)節(jié)軟骨組織可促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥、抑制軟骨基質(zhì)合成及刺激軟骨下骨重塑[5-7]，還可通過上調(diào)和活化蛋白水解酶對軟骨代謝起促分解作用[8-9]。脂肪因子包括瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素以及內(nèi)脂素等，其中，瘦素是最早被發(fā)現(xiàn)且為目前研究最多的脂肪因子，它可抑制食物攝入以及刺激能量消耗，并參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎性疾病[10-11]。研究表明，脂肪因子在OA的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用[12-13]。膝髕下脂肪墊(Infrapatellar Fat Pad, IPFP)是膝關(guān)節(jié)囊內(nèi)滑膜外與軟骨相鄰的脂肪組織，是膝關(guān)節(jié)局部脂質(zhì)和脂肪因子的來源，研究證明與IPFP有關(guān)的代謝作用可引起或加重軟骨損害以及關(guān)節(jié)炎癥和疼痛，此外，IPFP分泌的脂肪因子還能刺激滑膜中促炎性細(xì)胞因子和蛋白水解酶的表達(dá)[6, 14]。本研究通過制作OA膝脂肪墊培養(yǎng)液(Fat Conditioned Medium, FCM)并與正常及OA軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察FCM對正常及OA軟骨細(xì)胞的影響，旨在探討OA膝脂肪墊對關(guān)節(jié)軟骨的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 2015年10月～2016年7月收集的24例膝軟骨和膝脂肪墊均由骨科手術(shù)室提供，12例為女性膝關(guān)節(jié)急性外傷手術(shù)患者，12例為女性膝OA患者行關(guān)節(jié)置換術(shù)后，均排除其他膝關(guān)節(jié)病史，年齡均在40～55歲之間。所有實(shí)驗(yàn)方案均得到南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。主要器材及試劑包括胎牛血清、Ⅱ型膠原酶(Giboco公司)，胰蛋白酶、高糖不完全達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)、全蛋白提取試劑盒、免疫組化試劑盒、油紅染料(南京凱基生物有限公司)，瘦素抗體(武漢博士德生物工程研究所)，Ⅱ型膠原(Type Ⅱ Collagen, COL2)抗體、聚蛋白多糖(Aggrecan, Acan)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinase, MMP)-13抗體(Abcam 公司)，Western電泳儀(Bio-Rad，美國，型號164-5051)，電泳儀及濕式電轉(zhuǎn)移槽(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法 ①膝脂肪墊HE染色：將正常及OA膝脂肪墊浸入福爾馬林溶液，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，進(jìn)行病理分析。②瘦素免疫組化染色：將正常及OA膝脂肪墊分別制作石蠟切片，做免疫組織化學(xué)染色，即用型山羊血清，瘦素抗體(1∶100稀釋)，加酶標(biāo)二抗，DAB溶液顯色，玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察組織中瘦素蛋白的表達(dá)情況。③制作FCM[15]：將OA膝脂肪墊用PBS液沖洗2～3遍，去除纖維結(jié)締組織及血管，剪切至小碎塊大約50mg，再用PBS液沖洗2遍及無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基沖洗1遍。加入完全高糖DMEM培養(yǎng)基(含5%胎牛血清+鏈霉素100μg/ml+青霉素100IU/ml)置于37℃恒溫箱中24h，隨后替換為無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(1ml/0.3g 脂肪組織)于37℃恒溫箱中72h。最后用200目分子篩過濾脂肪墊并收集培養(yǎng)液，置于-80℃?zhèn)溆谩＂苘浌羌?xì)胞分離與培養(yǎng)：于急性外傷手術(shù)標(biāo)本的表面完整處提取正常軟骨細(xì)胞，于OA膝關(guān)節(jié)置換術(shù)標(biāo)本提取OA軟骨細(xì)胞。將膝軟骨用PBS液沖洗并剪切至1.0mm3的小碎片，移入15ml離心管并加入2ml 0.25%胰蛋白酶消化30min，再加入3ml 0.25%Ⅱ型膠原(TypeⅡ Collagen, COL2)酶，于37℃恒溫箱中消化4h，每半小時振蕩一次，加入3ml培養(yǎng)基終止消化，予1200rpm/min離心10min，棄上清，加入完全高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)吹打均勻后種植于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于5%CO2、95%空氣37℃恒溫培養(yǎng)箱中。每天用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90%時傳代。⑤實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)：將第2代正常軟骨細(xì)胞采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常組和正常+FCM培養(yǎng)組，第2代OA軟骨細(xì)胞采用隨機(jī)數(shù)字法分為OA組和OA+FCM培養(yǎng)組，其中在正常組和OA組中加入完全高糖DMEM培養(yǎng)基，在正常+FCM培養(yǎng)組和OA+FCM培養(yǎng)組中加入FCM，每天于顯微鏡下觀察，第14天將各組細(xì)胞予COL2免疫組化染色及油紅O染色，并收集各組細(xì)胞予Western blot檢測。⑥COL2免疫組化染色：將爬有細(xì)胞的蓋玻片用4%的多聚甲醛固定15min，COL2抗體(1∶100稀釋)，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考瘦素免疫組織化學(xué)染色。光學(xué)顯微鏡下可見軟骨細(xì)胞胞核深染，胞質(zhì)為大量COL2染色，呈棕色。⑦油紅O染色：將軟骨細(xì)胞用PBS沖洗2次，10%的福爾馬林固定15min，60%的異丙醇漂洗30s，PBS沖洗2次，油紅O染色2h，傾去染液，流水沖洗，蘇木精染色1min，傾去蘇木精，流水沖洗，中性樹膠+蓋玻片固定，脂滴被油紅染成橘紅色，細(xì)胞核被蘇木精染成藍(lán)色。⑧免疫印跡法檢測(Western blot)：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕式轉(zhuǎn)移電泳槽轉(zhuǎn)膜，聚偏二氟乙烯膜在5%的牛血清白蛋白中常溫震蕩封閉2h，分別加Ⅱ型膠原(TypeⅡ Collagen, COL2)抗體、聚蛋白多糖(Aggrecan, Acan)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMP)-13抗體和磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, GAPDH)抗體(1∶1000稀釋)，4℃孵育過夜，加二抗，常溫孵育2h，加顯影液，采用機(jī)器曝光。Image pro plus 6.0 圖像分析軟件對各組蛋白電泳條帶行COL2、Acan、MMP-13、GAPDH的灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 脂肪墊組織病理學(xué) 正常膝脂肪墊內(nèi)可見大量呈空泡狀的脂肪細(xì)胞(放大400倍)，彼此相連，見圖1a；OA膝脂肪墊內(nèi)亦可見大量脂肪細(xì)胞，脂肪細(xì)胞間質(zhì)有較多巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，呈藍(lán)色顆粒，見圖1b。

圖1 膝脂肪墊HE染色(×400)

注：a.正常膝脂肪墊；b.OA膝脂肪墊

2.2 瘦素免疫組織化學(xué)染色 正常膝脂肪墊瘦素免疫組織化學(xué)染色呈陽性反應(yīng)(0.63±0.02)，見圖2a；OA膝脂肪墊瘦素免疫反應(yīng)較正常組增多(0.71±0.02)，見圖2b。

圖2 正常及OA膝脂肪墊瘦素免疫組織化學(xué)染色(×200)

注：a.正常膝脂肪墊；b.OA膝脂肪墊；圖中黑色箭頭示脂肪細(xì)胞核，紅色箭頭示瘦素陽性

2.3 COL2免疫組織化學(xué)染色 OA組軟骨細(xì)胞內(nèi)的COL2免疫組化染色平均吸光度比正常組顯著降低(P<0.05)。與OA組相比，正常+FCM組軟骨細(xì)胞內(nèi)的COL2免疫組化染色平均吸光度無明顯差異(P>0.05)，而OA+FCM組顯著降低(P<0.05)。與正常+FCM組相比，OA+FCM組軟骨細(xì)胞內(nèi)的COL2免疫組化染色平均吸光度顯著降低(P<0.05)。見表1，圖3。

2.4 油紅O染色 OA組軟骨細(xì)胞內(nèi)的油紅O染色平均吸光度與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與OA組相比，正常+FCM組和OA+FCM組軟骨細(xì)胞內(nèi)的油紅O染色平均吸光度均有增高，但OA+FCM組增高更為顯著(P<0.05)。見表1，圖4。

組別nCOL2油紅O正常組60．34±0．030．43±0．02OA組60．22±0．02a0．41±0．03正常+FCM組60．24±0．020．57±0．02bOA+FCM組60．18±0．01bc0．62±0．01bc

與正常組比較，aP<0.05；與OA組比較，bP<0.05；與正常+FCM組相比，cP<0.05

圖3 4組軟骨細(xì)胞COL2免疫組化染色(×200)

注：a.正常組；b.OA組；c.正常+FCM組；d.OA+FCM組；圖中黑色箭頭示軟骨細(xì)胞核，紅色箭頭示COL2免疫組化染色陽性

圖4 4組軟骨細(xì)胞油紅O染色(×200)

注：a.正常組；b.OA組；c.正常+FCM組；d.OA+FCM組；圖中黑色箭頭示軟骨細(xì)胞核，紅色箭頭示細(xì)胞內(nèi)油紅O染色陽性

2.5 各組軟骨細(xì)胞中COL2、Acan和MMP-13蛋白Western檢測表達(dá)水平比較 OA組COL2、Acan的表達(dá)水平低于正常組(P<0.05)，而MMP-13的表達(dá)高于正常組(P<0.05)。與OA組相比，正常+FCM組3種蛋白的表達(dá)水平均無明顯差別；相較于正常組及正常+FCM組，OA+FCM組COL2、Acan表達(dá)水平降低(均P<0.05)，而MMP-13的表達(dá)水平增高(均P<0.05)，見表2，圖5。

組別nCOL2AcanMMP?13正常組60．49±0．030．63±0．040．05±0．01OA組60．28±0．06a0．26±0．05a0．34±0．05a正常+FCM組60．24±0．090．24±0．060．31±0．08OA+FCM組60．07±0．04bc0．10±0．03bc0．45±0．03bc

與正常組比較，aP<0.05；與OA組比較，bP<0.05；與正常+FCM組相比，cP<0.05

圖5 4組軟骨細(xì)胞各目標(biāo)蛋白電泳圖

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨是由少量軟骨細(xì)胞和大量細(xì)胞外基質(zhì)組成。軟骨細(xì)胞是軟骨組織內(nèi)唯一的細(xì)胞類型，其細(xì)胞形態(tài)、增殖能力及分泌COL2的量可反映軟骨細(xì)胞的活性[16]。細(xì)胞外基質(zhì)主要由軟骨細(xì)胞分泌，包括膠原(主要為COL2)和Acan，其中COL2占細(xì)胞外基質(zhì)總量的80%～90%，是軟骨細(xì)胞的特征性指標(biāo)。COL2可形成纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使軟骨具有抗張強(qiáng)度，Acan主要保持軟骨的彈性和黏度，其中COL2的降解是不可逆的[17]，由此可見COL2和Acan在維持軟骨的完整與功能中起重要作用。

近年來，越來越多的研究將脂肪組織與軟骨退行性變聯(lián)系在一起[18-19]。實(shí)驗(yàn)證明，采用高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠，其膝軟骨損傷水平與機(jī)械應(yīng)力引起的軟骨損傷相似[20]，并且通過飲食誘導(dǎo)的肥胖還可顯著增加小鼠創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度[21]。由此可見，脂肪組織可通過代謝途徑對軟骨產(chǎn)生破壞作用。脂肪組織主要由脂肪細(xì)胞構(gòu)成，其細(xì)胞間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等[22]。脂肪細(xì)胞可分泌眾多脂肪因子包括瘦素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素和抵抗素等，脂肪因子能以自分泌或旁分泌雙重方式刺激軟骨細(xì)胞。

在軟骨細(xì)胞中，瘦素通過結(jié)合軟骨細(xì)胞表面瘦素受體活化細(xì)胞內(nèi)促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK)信號通路，進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞MMP-13的表達(dá)以及誘導(dǎo)軟骨膠原釋放，對軟骨基質(zhì)代謝起促分解作用[23]，MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)最重要的蛋白水解系統(tǒng)，其中MMP-13是COL2最有效地蛋白水解酶[24]。OA軟骨的顯著受損區(qū)域相比未受損區(qū)域可表達(dá)更多的瘦素受體，并且瘦素在OA滑膜液中的表達(dá)水平顯著高于血清[25]。膝脂肪墊是位于膝關(guān)節(jié)囊內(nèi)、滑膜外并與軟骨相鄰的脂肪組織，是膝關(guān)節(jié)脂肪因子的局部來源，研究指出脂肪墊分泌的脂肪因子脂聯(lián)素和內(nèi)脂素顯著高于皮下脂肪組織[26]，并且隨著年齡或體重指數(shù)的增加，脂肪墊內(nèi)的脂肪細(xì)胞和浸潤的淋巴細(xì)胞數(shù)量會增多，增多的脂肪細(xì)胞將進(jìn)一步提高膝關(guān)節(jié)內(nèi)脂肪因子的水平[27-29]。此外，實(shí)驗(yàn)證明OA患者的脂肪墊相比正常脂肪墊可分泌更多的脂肪因子[30-31]，OA患者的脂肪墊相比其皮下脂肪可產(chǎn)生更多的炎癥細(xì)胞[32]，并且晚期OA患者的脂肪墊相比早期OA患者的脂肪墊可表達(dá)更多的炎性因子[33]。由此可見，脂肪墊作為膝關(guān)節(jié)組織的一部分可以調(diào)節(jié)膝關(guān)節(jié)炎癥和軟骨降解反應(yīng)。

本研究通過將正常膝脂肪墊與OA膝脂肪墊行HE染色提示OA脂肪墊可產(chǎn)生更多的炎癥細(xì)胞，并將正常膝脂肪墊與OA膝脂肪墊行瘦素免疫組織化學(xué)染色提示OA脂肪墊呈現(xiàn)更多的瘦素免疫反應(yīng)物，由此可見，OA脂肪墊可表達(dá)更多的炎性因子，第2代正常軟骨細(xì)胞生長快，而第2代OA軟骨細(xì)胞生長速度較慢，并且油紅O染色結(jié)果顯示正常及OA軟骨細(xì)胞內(nèi)均呈現(xiàn)少量脂質(zhì)成分，脂滴呈橘紅色，2組間的平均吸光度無明顯差異(P>0.05)。加入FCM后發(fā)現(xiàn)，正常+FCM培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞以多邊形為主，其中夾雜不少樹突樣細(xì)胞，生長速度慢，并且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量大小不一的透明空泡，隨著時間的增加，空泡數(shù)量也逐漸增多，此時軟骨細(xì)胞仍為多邊形或星形，經(jīng)油紅O染色后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多紅染顆粒，證明鏡下所見細(xì)胞內(nèi)的透明空泡為脂滴，正常+FCM培養(yǎng)組的油紅O染色平均吸光度比OA組顯著增高(P<0.05)，提示FCM培養(yǎng)下的正常軟骨細(xì)胞內(nèi)脂滴含量增多，軟骨細(xì)胞發(fā)生脂肪樣變。OA+FCM培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞主要呈樹突樣，生長速度緩慢，鏡下細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)大量透明空泡，經(jīng)油紅O染色后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒，其平均吸光度比正常+FCM組顯著增高(P<0.05)，說明FCM培養(yǎng)下的OA軟骨細(xì)胞脂滴明顯增加，OA+FCM培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞發(fā)生脂肪樣變較正常+FCM培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞更嚴(yán)重，進(jìn)一步證明OA膝脂肪墊能對軟骨細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用，而對OA軟骨細(xì)胞的破壞更嚴(yán)重。

由COL2免疫組化結(jié)果可見，OA脂肪墊通過分泌脂肪因子對軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝起促分解作用，結(jié)合上述油紅O染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了OA脂肪墊能對軟骨產(chǎn)生破壞作用。本研究進(jìn)一步通過Western Blot檢測證明脂肪因子在軟骨退行性變過程中可通過代謝途徑提高軟骨細(xì)胞MMP-13的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，最終引起軟骨損傷。

該實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新性表現(xiàn)在，通過將OA膝脂肪墊培養(yǎng)液與正常及OA軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)證明脂肪因子對軟骨細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用，并且對OA軟骨細(xì)胞產(chǎn)生更大的破壞作用。此外，本實(shí)驗(yàn)首次證明與OA膝脂肪墊培養(yǎng)液共培養(yǎng)的正常及OA軟骨細(xì)胞可發(fā)生脂肪樣變，并且OA軟骨細(xì)胞發(fā)生脂肪樣變更為顯著。然而，為何軟骨細(xì)胞會在與脂肪墊培養(yǎng)液共培養(yǎng)的狀態(tài)下會發(fā)生脂肪樣變，需要未來進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探討。

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