孫夢玲 ，黃樺 ，劉洪巖 ，趙彥華 ，薛暉

河蟹，學名中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）是我國的名貴水產(chǎn)品之一。江蘇省養(yǎng)殖規(guī)模達400余萬畝，養(yǎng)殖產(chǎn)量高達30余萬噸，產(chǎn)值超過兩百億元，河蟹產(chǎn)量不足江蘇省漁業(yè)產(chǎn)量的10%，而產(chǎn)值卻占江蘇省漁業(yè)產(chǎn)值的將近50%，同時江蘇省的河蟹產(chǎn)量占據(jù)了國內河蟹總產(chǎn)量的一半以上[1]。然而，伴隨著河蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，大閘蟹的病害暴發(fā)也相繼出現(xiàn)。2015年，江蘇省內多處大閘蟹養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)相繼發(fā)生嚴重病害，患病的蟹表現(xiàn)為肝胰腺壞死、逐漸發(fā)白水化，附肢空癟無力，病死率達40%以上，造成嚴重經(jīng)濟損失[2]。養(yǎng)殖戶稱此病為“水癟子”病，經(jīng)過丁正峰[3]研究發(fā)現(xiàn)，河蟹微孢子蟲（Hepatospora eriocheir）與河蟹“水癟子”病的發(fā)生存在密切關聯(lián)，并將“水癟子”病命名為河蟹肝胰腺壞死癥。微孢子蟲是一種有著廣泛寄主的真核單細胞生物，可以感染多種經(jīng)濟動物，如家蠶等。水生生物同樣是微孢子蟲的一大類寄主，微孢子蟲可感染智利王蟹（Lithodes santolla）、堪察加擬石蟹（Paralithodes camtschaticus）、扁足擬石蟹（Paralithodes platypus）、藍蟹（Callinectes sapidus）、首長黃道蟹（Cancer magister）等，微孢子蟲感染中華絨螯蟹由王文等[4]人首次報道。

趙彥華[5]通過對2015年7月至2016年1月的主養(yǎng)區(qū)發(fā)病河蟹進行感染率調查，劉洪巖[6]對2016年4—11月的河蟹主養(yǎng)區(qū)發(fā)病河蟹感染率進行調查，結果發(fā)現(xiàn)肝胰腺壞死癥的發(fā)生率與微孢子蟲的感染率成正相關[5]。劉洪巖通過使用蝸牛消化酶提取河蟹微孢子蟲基因組確認可以提高檢測靈敏性[6]，因此在相關前期研究的基礎上，我們在江蘇省內河蟹主養(yǎng)區(qū)進一步開展微孢子蟲感染率的調查及研究。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及處理

本次調查共選取武進、宜興、高淳、興化、金壇、常熟、寶應及揚中為病害監(jiān)測點及樣品采集點，各測報點定期匯報最新病情，同時實地走訪發(fā)病塘口，了解發(fā)病歷史，發(fā)病季節(jié)及發(fā)病癥狀。在每個采集點隨機選取養(yǎng)殖戶4～10戶進行樣品采集，采樣時間為2017年2月至2017年7月，在河蟹一殼、二殼及三殼的蛻殼時期進行跟蹤采集，分別為2月底至3月初、5月初及7月底至8月初，依據(jù)各地養(yǎng)殖面積，選取養(yǎng)殖戶6～10戶，每批次每個養(yǎng)殖戶塘口隨機選取河蟹10只，將活體置于保溫箱內帶回實驗室。在實驗室內，取活體河蟹肝胰腺組織約100 mg置于75%酒精，為后期PCR檢測做準備，剩余肝胰腺收集于eppendorf管內并編號后置于-80℃冰箱儲存。

1.2 材料

Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒購于上海生工生物有限公司，β-巰基乙醇購于Sigma，PCR反應Mix購于南京唯贊生物科技，100 bp DNA ladder購于南京唯贊生物科技，PCR儀為Biometra T-Gradient Thermoblock，電泳儀及凝膠成像儀為BIORAD，恒溫金屬浴為Bioer CHB-202，冷凍離心機為Eppendorf 5417R。

1.3 檢測方法

1.3.1 河蟹微孢子蟲基因組提取 河蟹微孢子蟲基因組的提取，在劉洪巖證實蝸牛酶消化液法可提高河蟹微孢子蟲檢出率的基礎上，采用Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒進行抽提，操作方法參照說明書。

1.3.2 PCR 檢測方法采用丁正峰建立的傳統(tǒng)PCR法，PCR上游引物為：Q2F 5'-AGGGTGTTAGATTTGTTCGCA-3'，下游引物為：Q2R 5'-CCGCATTCATGGATCTCTTACA-3'。檢測反應體系為：Q2F（10 mM）1uL，Q2R（10 mM）1 μL，樣本 DNA 1 μL，PCR mix 12.5 μL，dd H2O 9.5 μL，總反應體積為25 μL。PCR反應條件為：94℃預變性4 min；94℃變性 1 min，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，進行35個循環(huán)；72℃充分延伸10 min，后4℃保存待檢測。

1.3.3 瓊脂糖凝膠 取PCR反應產(chǎn)物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠含量為1%（提前加入核酸染料 Gold View），電壓120 V，電泳時間為35 min，電泳結束后將凝膠置于紫外燈下觀察PCR擴增結果。

2 結果

2.1 流行病學調查

“水癟子”病引起河蟹大規(guī)模死亡于2015年在興化市首次被報道，在臺風過境以后，發(fā)生了大規(guī)模死亡，并且一直持續(xù)到2016年底，連續(xù)兩年興化均為重災區(qū)，發(fā)病率達80%以上，病死率同樣高達40%以上。2016年“水癟子”引起的死亡從蘇北興化地區(qū)擴散至南京高淳，再至蘇南的武進、宜興甚至蘇州陽澄湖地區(qū)，2016年在蘇南地區(qū)由“水癟子”引起的河蟹病死率在20%～30%，宜興地區(qū)個別鄉(xiāng)鎮(zhèn)高于30%，陽澄湖地區(qū)也有水癟子典型癥狀死蟹發(fā)生，但病死率在5%以下，感染率不超過15%。2017年的“水癟子”病發(fā)生率較往年又有極大幅度的下降，在流行病學調查過程中，僅7月份高溫時期有常州武進區(qū)一例發(fā)病上報，其余測報點均未有發(fā)生“水癟子”病典型癥狀死亡的病例上報。

在武進地區(qū)發(fā)生的高溫后河蟹死亡病例，與由“水癟子”病引起的死亡癥狀相同，病蟹肝胰腺發(fā)白甚至水化，附肢空癟無力，河蟹進籠后無法逃離，發(fā)病時期也與典型“水癟子”蟹吻合，在夏季高溫后引起突發(fā)性批量死亡。

2.2 河蟹微孢子蟲感染率

通過跟蹤采樣發(fā)現(xiàn)，各地區(qū)微孢子蟲感染率不高，第一批樣品中僅武進及金壇地區(qū)發(fā)現(xiàn)有微孢子蟲感染，且感染率均低于5%（表1），在河蟹第二次蛻殼后，在興化、金壇及揚中地區(qū)的樣品中發(fā)現(xiàn)有微孢子蟲感染，感染率分別為2.7%、2.4%及3.5%（表2），在河蟹三殼以后，在武進地區(qū)有一家養(yǎng)殖戶在7月高溫期間發(fā)生河蟹死亡，發(fā)病癥狀為典型的河蟹肝胰腺壞死癥，從該養(yǎng)殖戶處采回樣品為100%陽性，在同批采樣的8家養(yǎng)殖戶中為唯一一家有陽性率檢出的塘口，本次采樣陽性率為16%，同時常熟地區(qū)及寶應地區(qū)在三殼以后首次有河蟹微孢子蟲檢出，陽性率為4.6%及2.7%（表3），經(jīng)過持續(xù)采樣，宜興及高淳兩地的河蟹，通過普通PCR方法未檢出有河蟹微孢子蟲感染。

表1 河蟹一殼后微孢子蟲感染率

表2 河蟹二殼后微孢子蟲感染率

表3 河蟹三殼后微孢子蟲感染率

3 討論

通過持續(xù)的流行病學調查及實驗室感染率檢測發(fā)現(xiàn)，2015年及2016年為“水癟子”病發(fā)生率及病死率較高的兩年，經(jīng)過趙彥華及劉洪巖的實驗室檢測同樣發(fā)現(xiàn)河蟹微孢子蟲的感染率在發(fā)病率高的養(yǎng)殖區(qū)域長期持高水平狀態(tài)，本次為期8個月的采樣，覆蓋了河蟹的大半個生長周期，同樣得到比較一致的檢測結果，即“水癟子”發(fā)病率與河蟹微孢子蟲帶毒率高度相關，表現(xiàn)出一致性，因此持續(xù)的流行病學調查間接證明了河蟹微孢子蟲為引起河蟹“水癟子”病的病原。因此，筆者建議可將河蟹微孢子蟲的感染率作為河蟹“水癟子”發(fā)病的監(jiān)控指標，在未來的生產(chǎn)實踐中，對其進行定期檢測，掌握其分布及感染情況，為“水癟子”病的防控提供參考，防止再次發(fā)生大規(guī)模暴發(fā)性死亡。在本次采樣調查中，發(fā)現(xiàn)武進地區(qū)唯一一例“水癟子”病典型發(fā)病案例，發(fā)生在7月長期高溫以后，與2015年興化首次發(fā)生河蟹“水癟子”病大規(guī)模死亡發(fā)生在臺風過境且后期持續(xù)高溫一樣，都是在極端天氣以后引起了被感染河蟹的死亡。因此，在實際生產(chǎn)中，要留意極端天氣的來臨，尤其在臺風、長期降雨及長時間高溫等天氣來臨前，要做好預防措施，可以提前補充免疫增強劑，增強抗應激能力，針對肝臟損傷，可以服用保肝護肝藥物，調節(jié)肝臟功能，提高河蟹機體免疫力及抗病能力[7]。

武進地區(qū)發(fā)現(xiàn)的高溫后發(fā)病的個例，在第一次跟蹤采樣時，檢出結果為100%陰性，但高溫后發(fā)生死亡，并且檢出強陽性，對于可能的原因，筆者認為：普通PCR檢測河蟹微孢子蟲的限度在10的3次方的水平；低于該數(shù)量級，則難以通過普通PCR測得。經(jīng)過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，首次采樣帶回的肉眼觀察健康且有活力的河蟹，體內河蟹微孢子蟲含量在10的2次方以下，因此筆者認為，在正常生長狀態(tài)下的河蟹，池塘養(yǎng)殖蟹及長江野生蟹也可能感染有少量河蟹微孢子蟲，極端天氣造成河蟹應激反應，免疫力下降，導致體內病原復制迅速提高，從而致病。

在通過此次流行病學調查及帶毒檢測的基礎上，筆者認為，后期需要進一步搞清楚的問題有：河蟹微孢子蟲的感染方式是垂直傳播還是受環(huán)境中微孢子蟲感染，在此基礎上才能進行最根本的防治，加強親本蟹及苗種蟹的檢驗檢疫，建立SPF蟹的養(yǎng)殖，從而降低河蟹的微孢子蟲感染率。

[1]朱凜，韓飛，朱成德.江蘇省河蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的歷史回顧[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2012，33（9）：23-24.

[2]吳加平，張鳳翔，韓玲.河蟹“水癟子”現(xiàn)象的思考與防治對策[J].科學養(yǎng)魚，2016（6）:14-16.

[3]Z Ding，Q Meng，H Liu，et al.First case of hepatopancreatic necrosis disease in pond-reared Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis，associated with microsporidian[J].Journal of Fish Diseases，2016，11（15）:1-9.

[4]W Wang，J Chen.Ultrastructural study on a novel microsporidian，Endoreticulatus eriocheir sp.nov.（Microsporidia，Encephalitozoonidae），parasite of Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis（Crustacea，Decapoda）[J].Journal of Invertebrate Pathology，2007，94（2）：77.

[5]趙彥華，劉洪巖，丁正峰，等.江蘇省河蟹主養(yǎng)區(qū)微孢子感染情況調查報告[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2017，38（01）:11-14.

[6]劉洪巖，趙彥華，孫夢玲，等.蝸牛消化酶提取河蟹微孢子蟲基因組反應條件的優(yōu)化[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2017（04）:35-39.

[7]周日東，王松剛，張鳳翔.河蟹水癟子病的發(fā)生與應急措施[J].科學養(yǎng)魚，2016（4）:92-92.