孫夢玲 ，黃樺 ，劉洪巖 ，趙彥華 ，薛暉

河蟹，學(xué)名中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）是我國的名貴水產(chǎn)品之一。江蘇省養(yǎng)殖規(guī)模達(dá)400余萬畝，養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)30余萬噸，產(chǎn)值超過兩百億元，河蟹產(chǎn)量不足江蘇省漁業(yè)產(chǎn)量的10%，而產(chǎn)值卻占江蘇省漁業(yè)產(chǎn)值的將近50%，同時(shí)江蘇省的河蟹產(chǎn)量占據(jù)了國內(nèi)河蟹總產(chǎn)量的一半以上[1]。然而，伴隨著河蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，大閘蟹的病害暴發(fā)也相繼出現(xiàn)。2015年，江蘇省內(nèi)多處大閘蟹養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)相繼發(fā)生嚴(yán)重病害，患病的蟹表現(xiàn)為肝胰腺壞死、逐漸發(fā)白水化，附肢空癟無力，病死率達(dá)40%以上，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2]。養(yǎng)殖戶稱此病為“水癟子”病，經(jīng)過丁正峰[3]研究發(fā)現(xiàn)，河蟹微孢子蟲（Hepatospora eriocheir）與河蟹“水癟子”病的發(fā)生存在密切關(guān)聯(lián)，并將“水癟子”病命名為河蟹肝胰腺壞死癥。微孢子蟲是一種有著廣泛寄主的真核單細(xì)胞生物，可以感染多種經(jīng)濟(jì)動物，如家蠶等。水生生物同樣是微孢子蟲的一大類寄主，微孢子蟲可感染智利王蟹（Lithodes santolla）、堪察加擬石蟹（Paralithodes camtschaticus）、扁足擬石蟹（Paralithodes platypus）、藍(lán)蟹（Callinectes sapidus）、首長黃道蟹（Cancer magister）等，微孢子蟲感染中華絨螯蟹由王文等[4]人首次報(bào)道。

趙彥華[5]通過對2015年7月至2016年1月的主養(yǎng)區(qū)發(fā)病河蟹進(jìn)行感染率調(diào)查，劉洪巖[6]對2016年4—11月的河蟹主養(yǎng)區(qū)發(fā)病河蟹感染率進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝胰腺壞死癥的發(fā)生率與微孢子蟲的感染率成正相關(guān)[5]。劉洪巖通過使用蝸牛消化酶提取河蟹微孢子蟲基因組確認(rèn)可以提高檢測靈敏性[6]，因此在相關(guān)前期研究的基礎(chǔ)上，我們在江蘇省內(nèi)河蟹主養(yǎng)區(qū)進(jìn)一步開展微孢子蟲感染率的調(diào)查及研究。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及處理

本次調(diào)查共選取武進(jìn)、宜興、高淳、興化、金壇、常熟、寶應(yīng)及揚(yáng)中為病害監(jiān)測點(diǎn)及樣品采集點(diǎn)，各測報(bào)點(diǎn)定期匯報(bào)最新病情，同時(shí)實(shí)地走訪發(fā)病塘口，了解發(fā)病歷史，發(fā)病季節(jié)及發(fā)病癥狀。在每個(gè)采集點(diǎn)隨機(jī)選取養(yǎng)殖戶4～10戶進(jìn)行樣品采集，采樣時(shí)間為2017年2月至2017年7月，在河蟹一殼、二殼及三殼的蛻殼時(shí)期進(jìn)行跟蹤采集，分別為2月底至3月初、5月初及7月底至8月初，依據(jù)各地養(yǎng)殖面積，選取養(yǎng)殖戶6～10戶，每批次每個(gè)養(yǎng)殖戶塘口隨機(jī)選取河蟹10只，將活體置于保溫箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，取活體河蟹肝胰腺組織約100 mg置于75%酒精，為后期PCR檢測做準(zhǔn)備，剩余肝胰腺收集于eppendorf管內(nèi)并編號后置于-80℃冰箱儲存。

1.2 材料

Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒購于上海生工生物有限公司，β-巰基乙醇購于Sigma，PCR反應(yīng)Mix購于南京唯贊生物科技，100 bp DNA ladder購于南京唯贊生物科技，PCR儀為Biometra T-Gradient Thermoblock，電泳儀及凝膠成像儀為BIORAD，恒溫金屬浴為Bioer CHB-202，冷凍離心機(jī)為Eppendorf 5417R。

1.3 檢測方法

1.3.1 河蟹微孢子蟲基因組提取 河蟹微孢子蟲基因組的提取，在劉洪巖證實(shí)蝸牛酶消化液法可提高河蟹微孢子蟲檢出率的基礎(chǔ)上，采用Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行抽提，操作方法參照說明書。

1.3.2 PCR 檢測方法采用丁正峰建立的傳統(tǒng)PCR法，PCR上游引物為：Q2F 5'-AGGGTGTTAGATTTGTTCGCA-3'，下游引物為：Q2R 5'-CCGCATTCATGGATCTCTTACA-3'。檢測反應(yīng)體系為：Q2F（10 mM）1uL，Q2R（10 mM）1 μL，樣本 DNA 1 μL，PCR mix 12.5 μL，dd H2O 9.5 μL，總反應(yīng)體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 1 min，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min，后4℃保存待檢測。

1.3.3 瓊脂糖凝膠 取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠含量為1%（提前加入核酸染料 Gold View），電壓120 V，電泳時(shí)間為35 min，電泳結(jié)束后將凝膠置于紫外燈下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查

“水癟子”病引起河蟹大規(guī)模死亡于2015年在興化市首次被報(bào)道，在臺風(fēng)過境以后，發(fā)生了大規(guī)模死亡，并且一直持續(xù)到2016年底，連續(xù)兩年興化均為重災(zāi)區(qū)，發(fā)病率達(dá)80%以上，病死率同樣高達(dá)40%以上。2016年“水癟子”引起的死亡從蘇北興化地區(qū)擴(kuò)散至南京高淳，再至蘇南的武進(jìn)、宜興甚至蘇州陽澄湖地區(qū)，2016年在蘇南地區(qū)由“水癟子”引起的河蟹病死率在20%～30%，宜興地區(qū)個(gè)別鄉(xiāng)鎮(zhèn)高于30%，陽澄湖地區(qū)也有水癟子典型癥狀死蟹發(fā)生，但病死率在5%以下，感染率不超過15%。2017年的“水癟子”病發(fā)生率較往年又有極大幅度的下降，在流行病學(xué)調(diào)查過程中，僅7月份高溫時(shí)期有常州武進(jìn)區(qū)一例發(fā)病上報(bào)，其余測報(bào)點(diǎn)均未有發(fā)生“水癟子”病典型癥狀死亡的病例上報(bào)。

在武進(jìn)地區(qū)發(fā)生的高溫后河蟹死亡病例，與由“水癟子”病引起的死亡癥狀相同，病蟹肝胰腺發(fā)白甚至水化，附肢空癟無力，河蟹進(jìn)籠后無法逃離，發(fā)病時(shí)期也與典型“水癟子”蟹吻合，在夏季高溫后引起突發(fā)性批量死亡。

2.2 河蟹微孢子蟲感染率

通過跟蹤采樣發(fā)現(xiàn)，各地區(qū)微孢子蟲感染率不高，第一批樣品中僅武進(jìn)及金壇地區(qū)發(fā)現(xiàn)有微孢子蟲感染，且感染率均低于5%（表1），在河蟹第二次蛻殼后，在興化、金壇及揚(yáng)中地區(qū)的樣品中發(fā)現(xiàn)有微孢子蟲感染，感染率分別為2.7%、2.4%及3.5%（表2），在河蟹三殼以后，在武進(jìn)地區(qū)有一家養(yǎng)殖戶在7月高溫期間發(fā)生河蟹死亡，發(fā)病癥狀為典型的河蟹肝胰腺壞死癥，從該養(yǎng)殖戶處采回樣品為100%陽性，在同批采樣的8家養(yǎng)殖戶中為唯一一家有陽性率檢出的塘口，本次采樣陽性率為16%，同時(shí)常熟地區(qū)及寶應(yīng)地區(qū)在三殼以后首次有河蟹微孢子蟲檢出，陽性率為4.6%及2.7%（表3），經(jīng)過持續(xù)采樣，宜興及高淳兩地的河蟹，通過普通PCR方法未檢出有河蟹微孢子蟲感染。

表1 河蟹一殼后微孢子蟲感染率

表2 河蟹二殼后微孢子蟲感染率

表3 河蟹三殼后微孢子蟲感染率

3 討論

通過持續(xù)的流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室感染率檢測發(fā)現(xiàn)，2015年及2016年為“水癟子”病發(fā)生率及病死率較高的兩年，經(jīng)過趙彥華及劉洪巖的實(shí)驗(yàn)室檢測同樣發(fā)現(xiàn)河蟹微孢子蟲的感染率在發(fā)病率高的養(yǎng)殖區(qū)域長期持高水平狀態(tài)，本次為期8個(gè)月的采樣，覆蓋了河蟹的大半個(gè)生長周期，同樣得到比較一致的檢測結(jié)果，即“水癟子”發(fā)病率與河蟹微孢子蟲帶毒率高度相關(guān)，表現(xiàn)出一致性，因此持續(xù)的流行病學(xué)調(diào)查間接證明了河蟹微孢子蟲為引起河蟹“水癟子”病的病原。因此，筆者建議可將河蟹微孢子蟲的感染率作為河蟹“水癟子”發(fā)病的監(jiān)控指標(biāo)，在未來的生產(chǎn)實(shí)踐中，對其進(jìn)行定期檢測，掌握其分布及感染情況，為“水癟子”病的防控提供參考，防止再次發(fā)生大規(guī)模暴發(fā)性死亡。在本次采樣調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)武進(jìn)地區(qū)唯一一例“水癟子”病典型發(fā)病案例，發(fā)生在7月長期高溫以后，與2015年興化首次發(fā)生河蟹“水癟子”病大規(guī)模死亡發(fā)生在臺風(fēng)過境且后期持續(xù)高溫一樣，都是在極端天氣以后引起了被感染河蟹的死亡。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，要留意極端天氣的來臨，尤其在臺風(fēng)、長期降雨及長時(shí)間高溫等天氣來臨前，要做好預(yù)防措施，可以提前補(bǔ)充免疫增強(qiáng)劑，增強(qiáng)抗應(yīng)激能力，針對肝臟損傷，可以服用保肝護(hù)肝藥物，調(diào)節(jié)肝臟功能，提高河蟹機(jī)體免疫力及抗病能力[7]。

武進(jìn)地區(qū)發(fā)現(xiàn)的高溫后發(fā)病的個(gè)例，在第一次跟蹤采樣時(shí)，檢出結(jié)果為100%陰性，但高溫后發(fā)生死亡，并且檢出強(qiáng)陽性，對于可能的原因，筆者認(rèn)為：普通PCR檢測河蟹微孢子蟲的限度在10的3次方的水平；低于該數(shù)量級，則難以通過普通PCR測得。經(jīng)過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，首次采樣帶回的肉眼觀察健康且有活力的河蟹，體內(nèi)河蟹微孢子蟲含量在10的2次方以下，因此筆者認(rèn)為，在正常生長狀態(tài)下的河蟹，池塘養(yǎng)殖蟹及長江野生蟹也可能感染有少量河蟹微孢子蟲，極端天氣造成河蟹應(yīng)激反應(yīng)，免疫力下降，導(dǎo)致體內(nèi)病原復(fù)制迅速提高，從而致病。

在通過此次流行病學(xué)調(diào)查及帶毒檢測的基礎(chǔ)上，筆者認(rèn)為，后期需要進(jìn)一步搞清楚的問題有：河蟹微孢子蟲的感染方式是垂直傳播還是受環(huán)境中微孢子蟲感染，在此基礎(chǔ)上才能進(jìn)行最根本的防治，加強(qiáng)親本蟹及苗種蟹的檢驗(yàn)檢疫，建立SPF蟹的養(yǎng)殖，從而降低河蟹的微孢子蟲感染率。

[1]朱凜，韓飛，朱成德.江蘇省河蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的歷史回顧[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2012，33（9）：23-24.

[2]吳加平，張鳳翔，韓玲.河蟹“水癟子”現(xiàn)象的思考與防治對策[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2016（6）:14-16.

[3]Z Ding，Q Meng，H Liu，et al.First case of hepatopancreatic necrosis disease in pond-reared Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis，associated with microsporidian[J].Journal of Fish Diseases，2016，11（15）:1-9.

[4]W Wang，J Chen.Ultrastructural study on a novel microsporidian，Endoreticulatus eriocheir sp.nov.（Microsporidia，Encephalitozoonidae），parasite of Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis（Crustacea，Decapoda）[J].Journal of Invertebrate Pathology，2007，94（2）：77.

[5]趙彥華，劉洪巖，丁正峰，等.江蘇省河蟹主養(yǎng)區(qū)微孢子感染情況調(diào)查報(bào)告[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2017，38（01）:11-14.

[6]劉洪巖，趙彥華，孫夢玲，等.蝸牛消化酶提取河蟹微孢子蟲基因組反應(yīng)條件的優(yōu)化[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2017（04）:35-39.

[7]周日東，王松剛，張鳳翔.河蟹水癟子病的發(fā)生與應(yīng)急措施[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2016（4）:92-92.