宋鋒,李峰＊,李玲,張夢夢,姚修杰,盧玉潔,包宇航,苗立中

（1.博興縣畜牧獸醫(yī)局，山東濱州 25660；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；4.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI）發(fā)生可對養(yǎng)禽業(yè)帶來毀滅性打擊，疫苗免疫是預(yù)防禽流感病毒（AIV）發(fā)生、傳播的有效手段[1，2]。我國實行了高致病性禽流感強制免疫措施，成效顯著。2017年秋季起，我國決定在家禽全面免疫禽流感H5亞型的基礎(chǔ)上，全面開展H7N9免疫[3]。魯北地區(qū)是黃河三角洲高效生態(tài)農(nóng)業(yè)核心規(guī)劃區(qū)，是山東省乃至全國主要商品肉鴨的生產(chǎn)區(qū)。為做好相應(yīng)的技術(shù)指導(dǎo)與服務(wù)工作，本實驗團隊于2017年8-9月，選擇部分櫻桃谷肉鴨養(yǎng)殖場，進行了重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）（以下簡稱H5+H7二價滅活疫苗）免疫與血清抗體監(jiān)測工作。

1 材料與方法

1.1 試驗鴨群

濱州市某縣區(qū)5家規(guī)?；B(yǎng)殖鴨場，分別標(biāo)記為A-E，全部采用全進全出養(yǎng)殖模式，養(yǎng)殖規(guī)模均為8,000～11,000只。

1.2 H5+H7二價滅活疫苗

政府調(diào)撥疫苗，國內(nèi)某廠家生產(chǎn)，共2個生產(chǎn)批號，分別為170864501，170874501。

1.3 檢測試劑

H5亞型（Re-8）、H7亞型血凝抑制抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自青島易邦生物工程有限公司；阿氏液、pH值為7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)由本實驗室自行配制。

1.4 試驗分組與采樣

A、D、E三家養(yǎng)殖場使用生產(chǎn)批號為170864501的疫苗，B、C兩家養(yǎng)殖場使用生產(chǎn)批號170874501的疫苗。均在7日齡免疫，免疫劑量為0.5mL/只。各場分別在7日齡、14日齡、21日齡、28日齡、35日齡隨機選擇26～32只鴨，翅靜脈采集血樣1mL/只，分離血清后，-40℃保存，統(tǒng)一檢測。

1.5 1%雞紅細胞混懸液

采集2～3只SPF公雞血液，混合后，自行配制。

1.6 檢測方法與結(jié)果判定

進行微量法[4]血凝（HA）、血凝抑制(HI)試驗。以完全抑制4單位抗原的血清最高稀釋度作為HI滴度，即血清效價。陰性對照血清HI效價≤2log2，陽性對照血清HI效價誤差≤log2時，試驗方可成立。HI效價≥4log2判為陽性；HI效價≤3log2判為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 H5N1 Re-8血清抗體檢測結(jié)果

743份血清樣品的H5N1 Re-8抗體檢測結(jié)果見表1及圖1。結(jié)果表明：7日齡時，有4個養(yǎng)殖場的平均抗體大于4.5log2；14-21日齡時，其平均抗體水平在 0.35log2～3.05log2，抗體陽性率為 0～42.11%；21日齡后，抗體水平明顯上升，至35日齡時有4個養(yǎng)殖場的平均抗體滴度高于4log2，3個養(yǎng)殖場的抗體陽性率高于70%。疫苗免疫后，各個養(yǎng)殖場的抗體數(shù)據(jù)呈現(xiàn)隨日齡增加先下降（至14-21日齡階段）后上升（21-35日齡階段）的明顯變化；35日齡時，除C養(yǎng)殖場外，其他4個養(yǎng)殖場抗體平均值均高于4log2。但14-28日齡階段5個養(yǎng)殖場H5N1 Re-8血清抗體的平均值均低于4log2（圖1）。

表1 H5N1 Re-8血清抗體的檢測結(jié)果

圖1 不同日齡H5N1 Re-8血清抗體平均值的變化曲線

表2 H7N9血清抗體的檢測結(jié)果

2.2 H7N9血清抗體檢測結(jié)果

743份血清樣品H7N9抗體檢測結(jié)果見表2及圖2。結(jié)果表明：7日齡時，5個養(yǎng)殖場的抗體陽性率均為0；14日齡時，僅有E養(yǎng)殖場的抗體陽性率為73.33%，其他4個養(yǎng)殖場的抗體陽性率均為0；21日齡時，除C養(yǎng)殖場的抗體陽性率為40%低于70%的合格標(biāo)準(zhǔn)外，其他4個養(yǎng)殖場的抗體陽性率均高于70%的合格標(biāo)準(zhǔn)；35日齡時，5個養(yǎng)殖場的抗體陽性率在88.89%-100%之間，全部合格。疫苗免疫后，E養(yǎng)殖場的抗體產(chǎn)生最為迅速，其他4個養(yǎng)殖場在14日齡后才逐漸產(chǎn)生抗體；A、D、E三個養(yǎng)殖場至28日齡后抗體開始下降；B、C兩養(yǎng)殖場在28-35日時齡抗體仍處于上升態(tài)勢（圖2）。

2.3 不同批次疫苗免疫后抗體檢測結(jié)果的比較

2.3.1 兩個不同生產(chǎn)批號疫苗免疫后H5N1 Re-8抗體檢測統(tǒng)計 結(jié)果見表3。應(yīng)用SPSS 13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析軟件對抗體陽性率、平均抗體滴度兩組數(shù)據(jù)進行TukeyHSD分析。結(jié)果顯示，p1=p2=1.000；p均大于0.05，差異不顯著。但從抗體產(chǎn)生速度、抗體平均值（圖3）等方面比較，在H5N1 Re-8免疫效果上，170864501批次要優(yōu)于170874501批次的疫苗。

2.3.2 兩個不同生產(chǎn)批號疫苗免疫后H7N9抗體檢測統(tǒng)計 結(jié)果見表4。應(yīng)用SPSS 13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析軟件對抗體陽性率、平均抗體滴度兩組數(shù)據(jù)進行TukeyHSD 分析。結(jié)果顯示，p3=1.000；p4=0.994，p均大于0.05，差異不顯著。從抗體產(chǎn)生速度、平均抗體滴度（圖4）比較，在H7N9免疫效果上，170864501批次要優(yōu)于170874501批次的疫苗。

3 小結(jié)與討論

3.1 禽流感H5N1 Re-8免疫后的抗體消長規(guī)律

對檢測結(jié)果的分析表明，7日齡時檢測到的禽流感H5N1Re-8抗體為母源抗體；7-21日齡時母源抗體滴度逐漸降至最低，疫苗免疫后逐漸誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了抗體；21日齡后抗體滴度快速提升。疫苗免疫后抗體滴度快速提升大約需要14d，35日齡時有4個養(yǎng)殖場的抗體平均滴度達到4log2，有3個養(yǎng)殖場的達到了70%的抗體陽性率合格標(biāo)準(zhǔn)，但有2-3周的時間處于免疫保護缺失狀態(tài)。

3.2 禽流感H7N9亞型疫苗免疫后的抗體消長規(guī)律

檢測結(jié)果顯示，5個養(yǎng)殖場的商品肉鴨沒有檢測到H7N9亞型的母源抗體。14日齡時，有1個養(yǎng)殖場的抗體陽性率超過了70%，但其平均抗體滴度為3.6log2，仍低于4log2的合格標(biāo)準(zhǔn)；21日齡時，有4個養(yǎng)殖場的抗體陽性率與平均抗體滴度均達到免疫的合格標(biāo)準(zhǔn)；28-35日齡時，5個養(yǎng)殖場的抗體滴度持續(xù)處于較高水平，且抗體陽性率均接近或超過90%，表明H7N9 H7-Re1株疫苗在免疫肉鴨14天后能夠產(chǎn)生有效的抗體保護，免疫保護期達到3周以上。

表3 兩批次疫苗免疫后H5N1 Re-8抗體的檢測結(jié)果統(tǒng)計

表4 兩批次疫苗免疫后H7N9抗體的檢測結(jié)果統(tǒng)計

圖3 兩批次疫苗免疫后H5N1 Re-8抗體的平均值

3.3 H5+H7二價滅活疫苗的免疫探討

圖4 兩批次疫苗免疫后H7N9抗體的平均值

3.3.1 免疫H5+H7二價滅活疫苗后的抗體檢測結(jié)果表明，35日齡時，H5N1 Re-8禽流感亞型疫苗免疫后有4個養(yǎng)殖場的平均抗體滴度高于4log2，3個養(yǎng)殖場的抗體陽性率高于70%；H7N9禽流感亞型疫苗免疫后有5個養(yǎng)殖場的平均抗體滴度高于4log2，5個養(yǎng)殖場的抗體陽性率均高于70%?；痉显浊懊庖呖贵w水平監(jiān)測達到70%的標(biāo)準(zhǔn)要求。從兩個批次疫苗免疫的效果分析，雖然各個養(yǎng)殖場間在抗體產(chǎn)生速度、抗體滴度水平方面存在批次間的差異，但整體比較來看兩個疫苗批次間免疫效果差異不顯著（P＞0.05），疫苗質(zhì)量穩(wěn)定。

3.3.2 做好防控工作 目前雖然H5+H7二價滅活疫苗雖然列入強制免疫計劃，但種禽場免疫后至生產(chǎn)出具有穩(wěn)定高滴度母源抗體的種卵還需要較長一段時間。其間，商品肉鴨在疫苗免疫前和疫苗免疫后的7-14d，存在母源抗體低下及疫苗抗體產(chǎn)生需要時間的問題，無法有效防護H7N9AIV的感染。因此，必須從加強種禽免疫、切實做好生物安全防護等多方面做好預(yù)防控制工作。

3.3.3 分析H5N1 Re-8抗體檢測結(jié)果 商品肉鴨均具有較高的免疫水平，證明種禽H5N1亞型免疫效果確實。但免疫疫苗后，免疫抗體產(chǎn)生與母源抗體衰減疊加后，有2～3周時間抗體水平較低，存在免疫空白期；一旦感染H5N1亞型，出現(xiàn)疫情的幾率和風(fēng)險較高。

3.3.4 從疫苗選擇的角度分析 選擇二價疫苗可以減少免疫次數(shù)、提高免疫效率；但在兩種母源抗體不一致的情況下，科學(xué)的選擇首免日齡至關(guān)重要[5]。另一方面，疫苗制備工藝中不同抗原含量優(yōu)化，免疫過程中程序優(yōu)化等需要進一步進行實驗研究。

綜上所述，建議進一步加強疫苗應(yīng)用監(jiān)測與免疫程序試驗，廣泛開展技術(shù)指導(dǎo)服務(wù)工作，提醒養(yǎng)殖場戶加強生物安全措施，防止疫病發(fā)生。同時，基于肉鴨飼養(yǎng)周期短、現(xiàn)行疫苗免疫產(chǎn)生抗體時間長等問題，建議通過有效提升母源抗體的方法來實現(xiàn)商品肉鴨全程被動免疫，達到有效保護的目的。禽流感新型疫苗的研制與合理防控等問題仍亟需解決?！?/p>

[1] 王有令,亓麗紅,徐懷英,等.櫻桃谷肉鴨H5N1亞型禽流感滅活疫苗（Re-6+Re-8）免疫程序研究 [J].中國家禽,2017,39(1)：60-63.

[2] 汪洋,韓燾,姜畔,等.新型甲型H7N9禽流感病毒研究進展[J].中國病毒病雜志,2015,5(1)：67-71.

[3] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部關(guān)于切實做好全國高致病性禽流感秋季免疫工作的通知.農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]24號.

[4] 中華人民共和國獸藥典2015年版.3403紅細胞凝集試驗法附錄28.

[5] 張評滸,任濤,唐應(yīng)華,等.免疫程序與母源抗體對H5禽流感疫苗免疫鴨和鵝HI抗體水平的影響 [J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(8)：638-642.