劉華棟，李婷婷，陸冰洋，王彩先，唐娟，丁樹榮，詹麗娥＊

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 山西太原 030032）

2016年10月28日山西省太谷縣某養(yǎng)雞場(chǎng)85日齡的蛋雞發(fā)生疾病。此養(yǎng)雞場(chǎng)存欄雞10,000只，由于近期發(fā)生疾病，死亡數(shù)量劇增，每天死亡數(shù)量30～40只，且數(shù)量逐日增加。大群雞精神狀態(tài)差，采食量和飲水量均下降。場(chǎng)主攜帶5只發(fā)病雞來筆者研究室診斷，以下是詳細(xì)診斷內(nèi)容。

1 臨床癥狀

病雞喜臥，雙翅下垂，伸頸張口呼吸，眼睛緊閉，呈打盹狀，反應(yīng)遲鈍，拉黃綠色水樣稀便。

2 病理變化

剖檢可見喉頭水腫且有黃色干酪樣分泌物堵塞，幾乎接近完全堵死。氣管切開可見管腔有黃色膿性分泌物，沖洗去掉分泌物可見氣管壁出血，并有散在的潰瘍?cè)詈蛪乃涝?。心臟和肝臟有黃色纖維素樣分泌物沉淀包裹，肝臟腫大呈現(xiàn)土黃色。腺胃乳頭出血，腺胃和肌胃交界處出血。十二指腸呈現(xiàn)散在的棗核樣出血，空回腸也有散在的點(diǎn)狀出血。盲腸扁桃體出血嚴(yán)重，直腸出血。脾臟腫大。腎臟腫大出血，呈現(xiàn)花斑腎。

3 實(shí)驗(yàn)室檢查

3.1 鑒別培養(yǎng)（普通培養(yǎng)和鑒別培養(yǎng)）

取病死雞的心、血液和肝臟樣品，無菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂上，置37℃恒溫培養(yǎng)24h后，可見普通瓊脂上形成圓形、隆起、光滑、濕潤和灰白色中等大小的菌落，而麥康凱瓊脂上形成紅色菌落，伊紅美藍(lán)瓊脂上則形成黑色帶金屬光澤的菌落。

3.2 病原鏡檢

挑取單個(gè)菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢可見染成紅色的短小桿菌。

3.3 生化鑒定

將純培養(yǎng)的病原菌進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見表1。由表1結(jié)果可以判定分離菌為大腸桿菌。鹽產(chǎn)堿；NAGA：N-乙酰-β-葡萄糖氨酶；AGAL：α-半乳糖苷酶；PHOS：磷酸酶；GlyA：氨基乙酸芳胺酶；ODC：鳥氨酸脫羧酶；LDC：賴氨酸脫羧酶；IHISa：組氨酸同化；cMT：PE葡萄糖酸酶；BGUR：β-D-葡萄糖醛酸酶；O129R：O/129耐受；GGAA：谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶；lMLTa：L-蘋果酸鹽同化；ELLM：ELLMAN；lLATa：L- 乳酸鹽同化

表1 分離菌的生化鑒定結(jié)果表

3.4 藥敏實(shí)驗(yàn)

采用K-B試紙擴(kuò)散法[1]，挑取大腸桿菌單個(gè)菌落均勻涂布于整個(gè)平板，將含有抗生素的藥敏紙片用燒灼滅菌的鑷子分別貼于平板表面，紙片之間間隔24mm以上，37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。測(cè)量藥敏紙片抑菌圈的直徑，參照CLSI手冊(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)作出判斷[2]，每次測(cè)定均以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922作參照。使用18種常規(guī)藥物對(duì)分離到的雞大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果可見，分離菌對(duì)頭孢曲松、粘桿菌素中敏，對(duì)慶大霉素、安普霉素、鏈霉素和阿米卡星高敏，其他常用抗菌藥物均耐藥。

3.5 傳染性喉氣管炎包涵體檢查

無菌條件下取出病雞喉頭和氣管黏膜上皮，涂片，在無水甲醇中固定3～5min，姬姆薩氏染色2h，無水甲醇脫色，沖洗，干燥鏡檢[3,4]，可見上皮細(xì)胞核內(nèi)有包涵體。結(jié)合臨床癥狀及剖檢病變確定其感染有傳染性喉氣管炎。

3.6 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

采集病雞喉氣管分泌物與雞傳染性喉氣管炎高免血清做瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，置于37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察，結(jié)果被檢樣品與高免血清孔之間形成清晰的白色沉淀線。

3.7 動(dòng)物試驗(yàn)

取病死雞氣管分泌物，按1∶5加生理鹽水稀釋，用棉簽蘸取稀釋液涂擦喉頭和上腭，接種于40日齡易感雞5只，再用生理鹽水接種同日齡雞5只作對(duì)照[5]。1d后即有雞出現(xiàn)呼吸道癥狀，3d后全部出現(xiàn)雞傳染性喉氣管炎典型的呼吸道癥狀，流淚，結(jié)膜發(fā)炎。病理剖檢可見喉頭和氣管出血。對(duì)照組未見異常變化。

3.8 ND的PCR鑒定

從發(fā)病雞的肺臟、肝臟、脾臟等器官取樣1g，剪碎混勻后取0.05g研磨，8,000rpm離心后取上清，使用新城疫病毒通用型RT-PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NDV，取已處理的樣品，加入裂解液600μL，充分顛倒混勻，室溫靜置3～5min。將液體吸入吸附柱中，13,000rpm離心30s。棄去收集管中的液體，加入600μL洗液，13,000rpm離心30s。重復(fù)上一步。棄去收集管中液體，13,000rpm空柱離心2min，以除去殘留的洗滌液。將吸附柱移入新的1.5mL離心管中，向柱中央加入洗脫液 50μL，室溫靜置1min，13000rpm離心30s，離心管中液體即為模板RNA。反轉(zhuǎn)錄條件為：42℃ 45min，94℃ 3min；PCR反應(yīng)條件為：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共循環(huán)35次，72℃延伸7min。使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，結(jié)果如圖1。

表2 大腸桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果單位：mm

由圖1結(jié)果可見，擴(kuò)增出明顯的條帶，與試劑盒里設(shè)定的擴(kuò)增片段大小相符。

4 診斷

圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)臨床癥狀、病理變化和實(shí)驗(yàn)室檢查，診斷為傳染性喉氣管炎、新城疫和大腸桿菌病混合感染。

5 治療

針對(duì)臨床分離到的病原和藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在飲水中添加阿米卡星治療大腸桿菌感染，肌肉注射新城疫Ⅰ系疫苗[6]，使用傳染性喉氣管炎弱毒疫苗點(diǎn)眼[7]，同時(shí)淘汰處理已發(fā)病的病雞。養(yǎng)殖場(chǎng)加強(qiáng)通風(fēng)、清掃和消毒工作。經(jīng)使用治療方案5天后，雞群整體精神恢復(fù)正常，無死亡。

6 討論

大腸桿菌為動(dòng)物體內(nèi)的一類條件性致病菌[8]，其發(fā)生與各種應(yīng)激因素有關(guān)，在衛(wèi)生條件差、通風(fēng)不良、飼養(yǎng)管理不當(dāng)及動(dòng)物免疫力下降的時(shí)候，容易誘發(fā)本病[9]，在有其他病原感染后也易繼發(fā)感染。大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性非常嚴(yán)重，山西地區(qū)雞源性大腸桿菌對(duì)青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素耐藥性均在50%以上，其中以青霉素類抗生素耐藥率最高[10]。這與本例大腸桿菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符。表明在山西地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)藥物的使用有所偏好，使得這些藥物過量使用，警醒本地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)在疾病治療過程中注意抗菌藥物的交替和輪換使用。

雞傳染性喉氣管炎是皰疹病毒感染，只能靠疫苗來預(yù)防，弱毒苗目前是使用最多的一類疫苗[11]。本例雞場(chǎng)發(fā)病后使用弱毒疫苗點(diǎn)眼后未發(fā)生新的病例，說明疫苗起到保護(hù)作用，但弱毒疫苗作為傳統(tǒng)防治雞傳染性喉氣管炎病的疫苗出現(xiàn)過毒力過強(qiáng)和毒力返強(qiáng)問題[12,13]，所以在使用雞傳染性喉氣管炎弱毒苗時(shí)要慎重。

本例雞場(chǎng)此前接種過兩次新城疫疫苗，分別為Ⅰ系苗肌注和Ⅳ系苗飲水，此次仍然發(fā)病，說明接種疫苗并不能完全抵御疾病發(fā)生，疾病的發(fā)生還與感染ND病毒毒力強(qiáng)弱以及基因型有關(guān)系，但應(yīng)注意監(jiān)測(cè)及保持較高抗體水平，高抗體水平和整齊度對(duì)強(qiáng)毒感染有更高的抵抗力[14]?！?/p>

[1] Andrews J M.BSAC working party on susceptibility testing.BSAC standardized disc susceptibility testing method [J].J Antimicrob Chemoth,2001,48(suppl 1)：43-57.

[2] 許宏濤,張秀珍.2004年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2005,21(4)：318-320.

[3] 黃坤松.雞傳染性喉氣管炎的診斷與防治 [J].福建畜牧獸醫(yī),2015,37(4)：39-40.

[4] 李文興,劉書印,高桂玲,等.雞傳染性喉氣管炎病的診斷及防治[J].當(dāng)代畜牧,2013(7)：11-12.

[5] 陳文新,張玉蘭.一起雞傳染性喉氣管炎并發(fā)大腸桿菌病的診治[J].中國家禽,2008,30(2)：45-46.

[6] 王玉茂,周海永,李峰.蛋雞新城疫與大腸桿菌混合感染的診治[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2014(3 下)：76-77.

[7] Coppo M J C,Devlin J M,Noormohammadi A H.Comparison of the replication and transmissibility of an infectious laryngotracheitis virus vaccine delivered via eye-drop or drinking-water[J].Avian Pathology,2012,41(1)：99-106.

[8] 賈松濤,劉星,宋慶華,等.孔雀新城疫繼發(fā)大腸桿菌病的診治[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(12)：205-206.

[9] 崔曉華,楊金生.肉雞非典型新城疫與大腸桿菌病混合感染[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013(11下)：103-104.

[10] 寧官保,牛藝儒,張鼎,等.雞源大腸桿菌耐藥性分析及中藥對(duì)大腸桿菌耐藥性消除作用的研究 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,46(6)：1018-1025.

[11] 程小果,王慧,程寧,等.雞傳染性喉氣管炎的流行與防控[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2016(10 下)：152-154.

[12] 劉鳳婷,劉志峰.用苗后引發(fā)雞傳染性喉氣管炎的診治[J].中國禽業(yè)導(dǎo)刊,2007,24(9)：39-39.

[13] 吳天琪,程小果,郭建友,等.傳染性喉氣管炎病毒田間分離株與疫苗株的遺傳進(jìn)化關(guān)系分析[J].中國家禽,2015,37(12)：18-21.

[14] 秦卓明,徐懷英,劉玉山,等.新城疫病毒抗原性和核心基因的動(dòng)態(tài)演化及防控思考[J].中國家禽,201133(4)：1-6.