劉華棟，李婷婷，陸冰洋，王彩先，唐娟，丁樹榮，詹麗娥＊

（山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 山西太原 030032）

2016年10月28日山西省太谷縣某養(yǎng)雞場85日齡的蛋雞發(fā)生疾病。此養(yǎng)雞場存欄雞10,000只，由于近期發(fā)生疾病，死亡數(shù)量劇增，每天死亡數(shù)量30～40只，且數(shù)量逐日增加。大群雞精神狀態(tài)差，采食量和飲水量均下降。場主攜帶5只發(fā)病雞來筆者研究室診斷，以下是詳細診斷內(nèi)容。

1 臨床癥狀

病雞喜臥，雙翅下垂，伸頸張口呼吸，眼睛緊閉，呈打盹狀，反應遲鈍，拉黃綠色水樣稀便。

2 病理變化

剖檢可見喉頭水腫且有黃色干酪樣分泌物堵塞，幾乎接近完全堵死。氣管切開可見管腔有黃色膿性分泌物，沖洗去掉分泌物可見氣管壁出血，并有散在的潰瘍灶和壞死灶。心臟和肝臟有黃色纖維素樣分泌物沉淀包裹，肝臟腫大呈現(xiàn)土黃色。腺胃乳頭出血，腺胃和肌胃交界處出血。十二指腸呈現(xiàn)散在的棗核樣出血，空回腸也有散在的點狀出血。盲腸扁桃體出血嚴重，直腸出血。脾臟腫大。腎臟腫大出血，呈現(xiàn)花斑腎。

3 實驗室檢查

3.1 鑒別培養(yǎng)（普通培養(yǎng)和鑒別培養(yǎng)）

取病死雞的心、血液和肝臟樣品，無菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂和伊紅美藍瓊脂上，置37℃恒溫培養(yǎng)24h后，可見普通瓊脂上形成圓形、隆起、光滑、濕潤和灰白色中等大小的菌落，而麥康凱瓊脂上形成紅色菌落，伊紅美藍瓊脂上則形成黑色帶金屬光澤的菌落。

3.2 病原鏡檢

挑取單個菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢可見染成紅色的短小桿菌。

3.3 生化鑒定

將純培養(yǎng)的病原菌進行生化鑒定，結果見表1。由表1結果可以判定分離菌為大腸桿菌。鹽產(chǎn)堿；NAGA：N-乙酰-β-葡萄糖氨酶；AGAL：α-半乳糖苷酶；PHOS：磷酸酶；GlyA：氨基乙酸芳胺酶；ODC：鳥氨酸脫羧酶；LDC：賴氨酸脫羧酶；IHISa：組氨酸同化；cMT：PE葡萄糖酸酶；BGUR：β-D-葡萄糖醛酸酶；O129R：O/129耐受；GGAA：谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶；lMLTa：L-蘋果酸鹽同化；ELLM：ELLMAN；lLATa：L- 乳酸鹽同化

表1 分離菌的生化鑒定結果表

3.4 藥敏實驗

采用K-B試紙擴散法[1]，挑取大腸桿菌單個菌落均勻涂布于整個平板，將含有抗生素的藥敏紙片用燒灼滅菌的鑷子分別貼于平板表面，紙片之間間隔24mm以上，37℃培養(yǎng)24h后觀察結果。測量藥敏紙片抑菌圈的直徑，參照CLSI手冊中的標準作出判斷[2]，每次測定均以標準質(zhì)控菌株ATCC25922作參照。使用18種常規(guī)藥物對分離到的雞大腸桿菌進行藥物敏感性實驗，結果見表2。

由表2結果可見，分離菌對頭孢曲松、粘桿菌素中敏，對慶大霉素、安普霉素、鏈霉素和阿米卡星高敏，其他常用抗菌藥物均耐藥。

3.5 傳染性喉氣管炎包涵體檢查

無菌條件下取出病雞喉頭和氣管黏膜上皮，涂片，在無水甲醇中固定3～5min，姬姆薩氏染色2h，無水甲醇脫色，沖洗，干燥鏡檢[3,4]，可見上皮細胞核內(nèi)有包涵體。結合臨床癥狀及剖檢病變確定其感染有傳染性喉氣管炎。

3.6 瓊脂擴散試驗

采集病雞喉氣管分泌物與雞傳染性喉氣管炎高免血清做瓊脂擴散試驗，置于37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察，結果被檢樣品與高免血清孔之間形成清晰的白色沉淀線。

3.7 動物試驗

取病死雞氣管分泌物，按1∶5加生理鹽水稀釋，用棉簽蘸取稀釋液涂擦喉頭和上腭，接種于40日齡易感雞5只，再用生理鹽水接種同日齡雞5只作對照[5]。1d后即有雞出現(xiàn)呼吸道癥狀，3d后全部出現(xiàn)雞傳染性喉氣管炎典型的呼吸道癥狀，流淚，結膜發(fā)炎。病理剖檢可見喉頭和氣管出血。對照組未見異常變化。

3.8 ND的PCR鑒定

從發(fā)病雞的肺臟、肝臟、脾臟等器官取樣1g，剪碎混勻后取0.05g研磨，8,000rpm離心后取上清，使用新城疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒檢測NDV，取已處理的樣品，加入裂解液600μL，充分顛倒混勻，室溫靜置3～5min。將液體吸入吸附柱中，13,000rpm離心30s。棄去收集管中的液體，加入600μL洗液，13,000rpm離心30s。重復上一步。棄去收集管中液體，13,000rpm空柱離心2min，以除去殘留的洗滌液。將吸附柱移入新的1.5mL離心管中，向柱中央加入洗脫液 50μL，室溫靜置1min，13000rpm離心30s，離心管中液體即為模板RNA。反轉錄條件為：42℃ 45min，94℃ 3min；PCR反應條件為：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共循環(huán)35次，72℃延伸7min。使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，結果如圖1。

表2 大腸桿菌藥敏實驗結果單位：mm

由圖1結果可見，擴增出明顯的條帶，與試劑盒里設定的擴增片段大小相符。

4 診斷

圖1 RT-PCR擴增結果

根據(jù)臨床癥狀、病理變化和實驗室檢查，診斷為傳染性喉氣管炎、新城疫和大腸桿菌病混合感染。

5 治療

針對臨床分離到的病原和藥敏實驗結果，在飲水中添加阿米卡星治療大腸桿菌感染，肌肉注射新城疫Ⅰ系疫苗[6]，使用傳染性喉氣管炎弱毒疫苗點眼[7]，同時淘汰處理已發(fā)病的病雞。養(yǎng)殖場加強通風、清掃和消毒工作。經(jīng)使用治療方案5天后，雞群整體精神恢復正常，無死亡。

6 討論

大腸桿菌為動物體內(nèi)的一類條件性致病菌[8]，其發(fā)生與各種應激因素有關，在衛(wèi)生條件差、通風不良、飼養(yǎng)管理不當及動物免疫力下降的時候，容易誘發(fā)本病[9]，在有其他病原感染后也易繼發(fā)感染。大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性非常嚴重，山西地區(qū)雞源性大腸桿菌對青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素耐藥性均在50%以上，其中以青霉素類抗生素耐藥率最高[10]。這與本例大腸桿菌分離株藥敏試驗結果相符。表明在山西地區(qū)養(yǎng)殖場對藥物的使用有所偏好，使得這些藥物過量使用，警醒本地區(qū)養(yǎng)殖場在疾病治療過程中注意抗菌藥物的交替和輪換使用。

雞傳染性喉氣管炎是皰疹病毒感染，只能靠疫苗來預防，弱毒苗目前是使用最多的一類疫苗[11]。本例雞場發(fā)病后使用弱毒疫苗點眼后未發(fā)生新的病例，說明疫苗起到保護作用，但弱毒疫苗作為傳統(tǒng)防治雞傳染性喉氣管炎病的疫苗出現(xiàn)過毒力過強和毒力返強問題[12,13]，所以在使用雞傳染性喉氣管炎弱毒苗時要慎重。

本例雞場此前接種過兩次新城疫疫苗，分別為Ⅰ系苗肌注和Ⅳ系苗飲水，此次仍然發(fā)病，說明接種疫苗并不能完全抵御疾病發(fā)生，疾病的發(fā)生還與感染ND病毒毒力強弱以及基因型有關系，但應注意監(jiān)測及保持較高抗體水平，高抗體水平和整齊度對強毒感染有更高的抵抗力[14]?！?/p>

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