王娟，郝赤子，廖維靖，張璇，萬芪

“豐富生存環(huán)境”可以增強學習和記憶能力[1]，誘導腦結構和功能的改變，對腦損傷修復具有顯著促進作用，《黃帝內經(jīng)》中的養(yǎng)生學十分重視形體與精神的整體調攝，強調動以養(yǎng)形，靜以養(yǎng)神，動靜結合，形神共養(yǎng)[2]，但養(yǎng)生缺乏科學合理的評價方法[3]。本研究將中醫(yī)養(yǎng)生理論，借助現(xiàn)代醫(yī)學技術和手段，應用于局灶性腦缺血的研究，在“豐富生存環(huán)境”的實踐基礎上，根據(jù)中醫(yī)養(yǎng)生“動以養(yǎng)形，靜以養(yǎng)神”理論的指導，制作“形神共養(yǎng)”的豐富生存環(huán)境模型，探討“形神共養(yǎng)”對局灶性腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及造模 選取健康雄性Sprague-Dawley大鼠共50只(SPF級)，體質量(220±20)g，飼養(yǎng)于武漢大學動物實驗中心的屏障環(huán)境中，飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫22℃，濕度72%，12h晝夜交替。術前禁食12h，不禁水。適應性飼養(yǎng)5d后，采用計算機隨機數(shù)字法將50只SD大鼠隨機分為假手術標準環(huán)境組(Sham Standard Environment，SS)10只、缺血豐富環(huán)境組(Ischemia Enriched Environment，IE)30只，缺血標準環(huán)境組(Ischemia Standard Environment，IS)10只。50只大鼠均參照廖維靖等[4]的線栓改良法制作大腦中動脈阻塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO)及再灌注模型，假手術組的線栓插入頸總動脈的深度為1cm，隨即拔出，結扎頸總動脈遠端的備用絲線。造模后對已經(jīng)蘇醒的大鼠參照Zea Longa法進行神經(jīng)功能缺損評分[5]，評分在1～3分為造模成功，納入實驗，否則棄之。對于造模失敗的大鼠，通過致死量麻醉后頸椎脫臼的方法對其實施安樂死[6]。

1.2 方法 ①“形神共養(yǎng)”的“豐富生存環(huán)境”模型的制作。a.“形養(yǎng)”籠尺寸長、寬、高分別為90cm、75cm、50cm，籠內放置木梯、臺階、網(wǎng)格、秋千、繩索等物品供動物攀爬，放置塑料管道、跑輪等供動物自主運動及探索，各種大小和顏色的球、積木供動物玩耍[1,7]?；\內物品每天一換，隨機更換物品擺放的位置，保持新鮮感。食物和水可自由獲取，偶爾給予葵花籽、饅頭、紅薯等，每籠可放置8～12只大鼠。b.“神養(yǎng)”籠尺寸同“形養(yǎng)”籠，籠內只放置墊料、食物、水，不放置誘發(fā)大鼠主動運動和探索的物品。每籠可放置8～12只大鼠。c.標準籠尺寸長、寬、高分別為44cm、32cm、20cm，每籠3～4只大鼠?；\內放置墊料、食物和水，籠內無其他設施。②大鼠術后休養(yǎng)3d，缺血豐富環(huán)境組被隨機分為3組：“形養(yǎng)”組(IE1)(n=8)、“神養(yǎng)”組(IE2)(n=8)和“形神共養(yǎng)”組(IE3)(n=8)。IE1組居于“形養(yǎng)”籠中，每天入住4h(8:30～12:30)，其余時間居于標準籠；IE2組居于“神養(yǎng)”籠中，每天入住4h(12:30～16:30)，其余時間居于標準籠。IE3組大鼠先居于“形養(yǎng)”籠中4h(8:30～12:30)，后居于“神養(yǎng)”籠中4h(12:30～16:30)，其余時間居于標準籠[8]。SS組(n=9)及IS組(n=8)一直居住于標準籠中。

1.3 評定標準 ①Morris水迷宮實驗：干預4周后，進行為期6d的水迷宮實驗。水迷宮直徑120cm，高60cm，平臺直徑9cm，高30cm，水面高出平臺2cm，水溫保持在(22±1)℃，實驗時將適量墨汁倒入水池中攪勻，直至看不見水面下的平臺[7,9]。定位航行實驗，水迷宮隨機劃分為4個象限，將平臺放置于其中一個象限中央。分別選取4個象限之間的交點作為A、B、C、D 4個入水點。a.第1～5天記錄逃避潛伏期時，在實驗開始時，將大鼠頭部面向池壁，輕放入水池，直到大鼠找到平臺并在平臺上停留3s。記錄大鼠尋找平臺的時間，即逃避潛伏期。每次尋找平臺的時間定為60s，如果大鼠在規(guī)定時間內找不到平臺，用木棍引導大鼠找到平臺，并學習20s后，將大鼠拿走。每只大鼠每天從4個不同象限入水訓練各1次，兩次訓練間隔大于20min，取4次訓練時間的平均值作為每天定位航行實驗的逃避潛伏期；b.第6天測試空間探索實驗，將平臺移除，大鼠從原平臺所在象限的對角線位置入水，記錄30s內大鼠在原平臺所在象限的時間。②免疫組織化學染色：水迷宮測試結束后大鼠稱重，用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后，迅速打開胸腔，充分暴露心臟，用50ml注射器針頭插入左心室，剪開右心耳，經(jīng)心臟快速灌注生理鹽水100～150ml，再用4%的多聚甲醛溶液100～150ml進行灌注，先快后慢。灌注成功后立即斷頭取腦組織，冠狀切取視交叉前2mm到視交叉后2mm組織塊，浸泡于4%多聚甲醛固定液中，24h后進行脫水、浸蠟、石蠟包埋，切成4μm石蠟切片。采用Envision兩步法進行免疫組化染色，免疫組化選用一抗為抗大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF)兔多克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG；染色標記的物質為腦源性神經(jīng)生長因子發(fā)生抗原抗體反應后的陽性產物。染色完成后每個腦組織隨機選取5張切片，在顯微鏡下(×200)分別于梗死灶周邊區(qū)及海馬齒狀回(Dentate gyrus,DG)區(qū)隨機選取3個不重疊視野攝片。采用專業(yè)圖片分析軟件Image-Pro Plus 6.0 系統(tǒng)進行圖像分析，分別測定梗死灶周邊皮質及海馬DG區(qū)BDNF陽性反應產物的累積光密度值(Integrated Optical Density，IOD)。

IE1組 IE2組 IE3組 IS組 SS組

圖15組大鼠腦梗死灶周圍皮質BDNF的表達(×200)

IE1組 IE2組 IE3組 IS組 SS組

圖25組大鼠海馬DG區(qū)BDNF的表達(×200)

2 結果

2.1 Morris水迷宮結果 各組組內5d訓練的潛伏期隨時間變化差異有統(tǒng)計學意義(F4,36=121.274，P<0.01)，每個時間點各組間水迷宮訓練的潛伏期差異有統(tǒng)計學意義(F4,36=4.877，P<0.01)。第1天，SS、IE3組大鼠在水迷宮中的逃避潛伏期比IE1、IE2、IS組大鼠短(均P<0.05)；第4天，SS和IE3組大鼠的逃避潛伏期均比IS短(P<0.05，0.01)；第5天，SS、IE1、IE3組逃避潛伏期均比IS組短(P<0.05，0.01)，且IE1、IE3組與SS組之間無顯著性差異。見表1。

第6天的水迷宮空間探索實驗中，IE1、IE2、IE3、IS及SS組目標象限停留時間分別為9.58±2.96、8.97±1.29、9.70±2.24、5.94±1.70及11.82±2.19s，各組大鼠在對原平臺的記憶方面差異有統(tǒng)計學意義(F4,36=5.131，P<0.05)；IE1、IE2、IE3組大鼠均比IS組在目標象限停留的時間長(P<0.05，0.01)；但是IE1、IE3組和SS組之間差異無顯著性意義。

組別第1天第2天第3天第4天第5天IE1組48.82±9.6230.71±10.9421.36±9.2017.17±9.2714.59±6.02aIE2組50.45±6.6932.76±11.4627.67±12.6822.06±10.0620.13±14.26IE3組39.85±9.63abc27.57±10.1217.19±7.08ab15.23±4.46a14.30±9.01aIS組54.70±6.0636.98±10.8428.67±6.5025.59±7.7025.89±6.13SS組38.09±5.35abc24.71±10.34a17.82±8.61ab13.52±7.18ab12.15±6.31a

與同時間點IS組比較，aP<0.05；與同時間點IE2組比較，bP<0.05；與同時間點IE1組比較，cP<0.05

2.2 免疫組織化學檢測結果 在光學顯微鏡下觀察，大鼠腦梗死周邊皮質及海馬DG區(qū)均可見BDNF免疫組化陽性細胞，陽性細胞胞體呈圓形或橢圓形，胞核較大，胞漿呈棕黃色或深棕黃色。假手術組皮質及DG區(qū)也有表達，但表達相對較少。不同分組間BDNF蛋白的表達在梗死灶周圍皮質及缺血側海馬DG部位差異均有統(tǒng)計學意義(F4,36=10.919，P<0.01；F4,36=21.349，P<0.01)。在梗死灶周圍皮質部位IE1、IE2、IE3組BDNF蛋白的表達均比SS組高，且IE1、IE3組BDNF蛋白的表達比IS組高，IE3組BDNF蛋白的表達較IE1、IE2組高(均P<0.05)。在缺血側海馬DG部位，IE1、IE2、IE3組BDNF蛋白的表達均比IS、SS組高(均P<0.05)，且IE1、IE3組的蛋白表達較IE2高(均P<0.05)。見圖1，圖2，表2。

組別n梗死周邊皮質海馬DGIE1組87763.33±803.12ab2745.39±435.224abcIE2組87357.92±642.89a2267.40±414.07abIE3組88724.95±636.53abcd3162.89±409.71abcIS組86597.07±981.491770.86±336.66SS組96306.96±603.971377.66±290.86

與SS組比較，aP<0.05；與IS組比較，bP<0.05；與IE2組比較，cP<0.05；與IE1組比較，dP<0.05

3 討論

《黃帝內經(jīng)》中的養(yǎng)生學十分重視形體與精神的整體調攝，“動以養(yǎng)形”是指運動可以促使人體氣血充盈、使精氣更加流通，能夠增強人體生理的氣化作用，提高人體抵抗疾病的能力。“靜以養(yǎng)神”是指保持心情的寧靜、舒暢、專一，能夠使臟腑氣機協(xié)調、通暢[2]。事實上人體完成任何一項動作，都是動與靜的有機結合，只不過是從形式上看以哪一種方式為主。養(yǎng)形側重于動，這里的“動”是指運動形體而言，順應自然以利其形，調攝飲食養(yǎng)其形，運動鍛煉強其形?！办o”是相對的概念，不是絕對的靜止，是指精神內斂而言。大鼠喜群居生活，有研究發(fā)現(xiàn)長期獨居容易使動物產生焦慮感[10]，獨居大鼠與群居大鼠相比，更加容易激惹。也有研究表明，社會孤立產生的壓力可能會導致皮質酮水平增加，而皮質酮可能會導致海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷[11]，從而加重缺血性腦損傷。實驗中標準環(huán)境的特點是活動空間狹小、單調，各種刺激和活動訓練很有限，再加上群體成員少，社會交往機會遭到剝奪。相反，豐富生存環(huán)境的活動空間較大，里面放置的物體豐富而新奇，群體成員較多，除了能夠提供充分的多感官刺激、運動和社交刺激外，還能夠為動物提供訓練學習機會。

“形神共養(yǎng)”能夠提高腦缺血大鼠空間學習能力及記憶能力，從而改善腦缺血大鼠的認知功能。實驗中隨著水迷宮的不斷訓練，大鼠可以通過周圍環(huán)境中的空間線索形成對平臺位置的記憶，尋找平臺的逃避潛伏期逐漸縮短，這與Birch[12]的報道基本一致。在水迷宮實驗的最后IE1組、IE3組與SS組差異不顯著，水迷宮成績幾乎恢復到正常大鼠水平，而IS組大鼠學習記憶能力也隨著訓練的加強，有一定程度的改善，可能是腦缺血后功能自發(fā)性恢復的結果。

豐富環(huán)境作為影響腦可塑性的外界因素其分子機制在一定程度上歸功于神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的作用。有研究認為腦缺血缺氧損傷后，BDNF及其受體TrkB基因表達增加，特別是在腦梗死灶周圍皮質和海馬區(qū)域更加突出[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)“形神共養(yǎng)”能促進梗死灶周邊皮質和海馬DG區(qū)BDNF的表達，有利于腦缺血大鼠運動功能以及認知功能的恢復。這與Gobbo等[15]的研究基本一致。大鼠腦缺血后缺血灶周圍皮質、海馬部位BDNF表達存在著一定的規(guī)律[16-17]，也有研究顯示BDNF在腦缺血后3d開始增高，7d后表達持續(xù)增強達高峰，30d后表達下降[18-19]。而BDNF在海馬不同部位的表達也存在著一定差異：有研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后BDNF在海馬缺血耐受區(qū)域CA3、CA4以及DG區(qū)反而比缺血敏感區(qū)CA1表達高出很多[20]?？赡苁窃谀X缺血發(fā)生后，海馬CA3、CA4以及DG區(qū)通過自身代償作用，調節(jié)內源性BDNF的表達，從而促進了受損神經(jīng)元的修復和再生。

由此可見，“形神共養(yǎng)”的豐富生存環(huán)境有利于促進局灶性腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力的恢復，促進局灶性腦缺血再灌注大鼠梗死周邊皮質和海馬齒狀回區(qū)BDNF的表達，從而促進腦缺血大鼠功能的恢復。其可能機制是“形神共養(yǎng)”的豐富的生存環(huán)境中的多樣化的刺激和訓練促進了大腦可塑性的變化，使神經(jīng)系統(tǒng)的功能重組和代償，且“形養(yǎng)”與“神養(yǎng)”相結合的“形神共養(yǎng)”方式在某些方面更優(yōu)于單純“形養(yǎng)”與“神養(yǎng)”。

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