呂龍輝，黃曉愨，熊小明，張 旭，楊志惠，方紅雁

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科，四川瀘州 6460000；2.重鋼總醫(yī)院耳鼻喉科，重慶 400081；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，四川瀘州 64600；5.重慶市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 400014)

·論 著·

鼻咽癌外泌體miR-20a通過(guò)靶向BCL2L11基因抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞凋亡*

呂龍輝1,2，黃曉愨2，熊小明3，張 旭4，楊志惠3，方紅雁1,5△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科，四川瀘州 6460000；2.重鋼總醫(yī)院耳鼻喉科，重慶 400081；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，四川瀘州 64600；5.重慶市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 400014)

目的 探索鼻咽癌外泌體microRNA是否通過(guò)靶向凋亡基因而抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)凋亡。方法 通過(guò)生物信息學(xué)方法確定目標(biāo)microRNA及其靶基因，檢測(cè)鼻咽癌患者血清及鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體內(nèi)miR-20a的表達(dá)量。應(yīng)用miR-20a的擬似物及抑制物轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞；并檢測(cè)干預(yù)后的凋亡指數(shù)及凋亡通路相關(guān)蛋白。結(jié)果 miR-20a在鼻咽癌外泌體中表達(dá)顯著上調(diào)。miR-20a的靶基因?yàn)锽CL2L11，過(guò)表達(dá)miR-20a可以抑制巨噬細(xì)胞凋亡，且凋亡通路相關(guān)蛋白Bim、caspase-9和caspase-3均顯著減少(P<0.05)。結(jié)論 miR-20a通過(guò)抑制Bim-caspase-9-caspase-3凋亡途徑的活化從而抑制鼻咽癌中TAM凋亡。

鼻咽腫瘤；外泌體；miR-20a；BCL2L11；巨噬細(xì)胞

鼻咽癌是高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一[1]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAM)在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]，在鼻咽癌中也是如此[3-4]。在TAM發(fā)揮促癌作用的過(guò)程中，表現(xiàn)出凋亡受抑制的現(xiàn)象，在可能參與調(diào)節(jié)TAM凋亡的因素中，來(lái)自腫瘤細(xì)胞的外泌體的microRNA(miRNA)可能是一個(gè)重要因素。相關(guān)研究表明，在鼻咽癌中，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體中有大量miRNA，其中有一些是顯著上調(diào)的[5]。本研究借助生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件對(duì)上述miRNA的可能靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-20a-5p(以下簡(jiǎn)稱miR-20a)可能通過(guò)抑制BCL2L11和CASP2基因而參與了抑制凋亡。本研究對(duì)鼻咽癌外泌體中的miR-20a是否通過(guò)靶向BCL2L11或CASP2基因抑制TAM凋亡，以及相關(guān)的機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 抗體F4/80購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；抗體Bim、caspase-2和α-Tubulin均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；人正常鼻咽上皮細(xì)胞株NP69和鼻咽癌細(xì)胞株5-8F購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)；人單核/巨噬細(xì)胞分離試劑Ficoll-Paque購(gòu)自GE公司；人血清及培養(yǎng)基外泌體提取試劑盒、miR-20a抑制物和擬似物及各自相應(yīng)的對(duì)照試劑均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 生物信息學(xué)檢索方法 使用TargetScan、MicroCosm和miRTarBase 3個(gè)在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)即有研究證實(shí)了的在鼻咽癌中表達(dá)顯著上調(diào)的miRNA的靶mRNA；從預(yù)測(cè)結(jié)果中找出3個(gè)軟件預(yù)測(cè)的交集；再借助UniProt在線數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出與凋亡功能相關(guān)的候選靶mRNA及對(duì)應(yīng)的miRNA；最后利用miRanda在線數(shù)據(jù)庫(kù)/軟件預(yù)測(cè)miRNA的相互作用位點(diǎn)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方(SP)法 切片脫蠟至水后，檸檬酸鹽液加熱修復(fù)抗原，滅活后加一抗F4/80過(guò)夜，第2天加生物素標(biāo)記二抗，然后滴加SP，用DAB顯色。最后復(fù)染蘇木素并脫水、透明、封片。

1.4 外泌體分離及電鏡成像 患者血清來(lái)源：選取10例臨床明確診斷鼻咽癌的患者，同時(shí)招募10名健康志愿者；分別抽取他們的空腹靜脈血12 mL。外泌體提取按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，簡(jiǎn)言之：將樣本于2 000×g 離心20 min后轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入外泌體分離劑混勻后于4 ℃靜置30 min至2 h；然后4 ℃，15 000×g 離心30 min；棄上清液即得外泌體。取PBS 重懸的外泌體50 μL，使之吸附于帶有聚醋酸甲基乙烯脂支持膜的銅網(wǎng)上，再經(jīng)2% 磷鎢酸染色，使用透射電鏡觀察、攝片。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng) NP69細(xì)胞使用K-SFM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，5-8F細(xì)胞使用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2。

1.6 人巨噬細(xì)胞的分離和激活 按照Ficoll-Paque試劑的流程對(duì)健康志愿者的外周血離心獲得人巨噬細(xì)胞，將其用培養(yǎng)基稀釋，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要接種于24孔板或96孔板；然后在培養(yǎng)基中加入脂多糖(LPS，100 ng/mL)和干擾素(IFN-γ，20 ng/mL)作為刺激因子模擬體內(nèi)炎性環(huán)境[6]。

1.7 外泌體熒光標(biāo)記、成像及巨噬細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜紅色熒光染料PKH26 標(biāo)記過(guò)的外泌體DMEM重懸液替換掉24孔板中培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h；然后固定、染色、觀察和攝片[7]。

1.8 不同來(lái)源外泌體處理巨噬細(xì)胞及相關(guān)檢測(cè)

1.8.1 外泌體處理巨噬細(xì)胞 將不同來(lái)源提取的外泌體以200 ng/mL的終濃度加入分離培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞；相應(yīng)分為NP69組、5-8F組、鼻咽癌患者組、健康志愿者組和不加外泌體的對(duì)照組。

1.8.2 凋亡指數(shù)測(cè)定 外泌體處理72 h后收集各組巨噬細(xì)胞并使用Annexin V/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

1.8.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 外泌體處理72 h后提取各組巨噬細(xì)胞總蛋白，按常規(guī)流程進(jìn)行Western blot檢測(cè)caspase-2和Bim蛋白定量。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外泌體內(nèi)miR-20a的表達(dá) 按常規(guī)流程檢測(cè)NP69組、5-8F組、鼻咽癌患者組、健康志愿者組的培養(yǎng)基或血清中分離的外泌體中的miR-20a的表達(dá)，PCR反應(yīng)步驟:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)以U6為內(nèi)參照。miR-20a引物序列:上游引物5′-GCT CA GTT CGC TCT GAG CAG G-3′，下游引物5′-CAG GGT CCC AGT GGA GGT-3′；U6引物序列:上游引物5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.10 miR-20a擬似物及抑制物的轉(zhuǎn)染 將5-8F細(xì)胞接種于24孔板中，之后用終濃度為1 μmol/L的擬似物、擬似物對(duì)照、抑制物和抑制物對(duì)照工作液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后提取培養(yǎng)基中的外泌體并與原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞共孵育。經(jīng)過(guò)處理的巨噬細(xì)胞72 h后進(jìn)行凋亡指數(shù)檢測(cè)及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bim蛋白、caspase-9蛋白和caspase-3蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)檢索結(jié)果 經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：鼻咽癌患者血清或者鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)基中表達(dá)顯著上調(diào)的miRNA中miR-20a與凋亡有最密切的關(guān)系，其與凋亡有關(guān)的候選靶基因?yàn)锽CL2L11和CASP2基因(分別編碼Bim和caspase-2)。其中BCL2L11 mRNA存在兩個(gè)與miR-20a互補(bǔ)的區(qū)域。

2.2 鼻咽癌組織中巨噬細(xì)胞的檢測(cè)及外泌體分離、成像 經(jīng)巨噬細(xì)胞特異性抗體F4/80的免疫組織化學(xué)染色，巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色；可見(jiàn)大量巨噬細(xì)胞散布于癌巢及周邊間質(zhì)中，見(jiàn)圖1。從鼻咽癌患者的血清及5-8F細(xì)胞的培養(yǎng)基中均可以分離出豐富的外泌體，經(jīng)透射電鏡成像，這些外泌體為圓形的膜狀結(jié)構(gòu)，直徑約80～120 nm，見(jiàn)圖2。

圖1 鼻咽癌組織的F4/80免疫組織化學(xué)染色(×400)

圖2 外泌體的透射電鏡成像

2.3 巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)及對(duì)外泌體的攝取 由健康志愿者外周血分離獲得的人巨噬細(xì)胞鏡下呈圓形或橢圓形，常有不規(guī)則突起或偽足，見(jiàn)圖3。在熒光顯微鏡下可以見(jiàn)到巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)吞噬了數(shù)量不一并標(biāo)記了紅色熒光染料的外泌體，見(jiàn)圖4。

圖3 巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)

2.4 不同來(lái)源外泌體處理巨噬細(xì)胞后的相關(guān)檢測(cè) 來(lái)自5-8F組和鼻咽癌患者組提取的外泌體處理的巨噬細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著低于對(duì)照組、NP69組和健康志愿者組(P<0.05)，見(jiàn)圖5。各組caspase-2蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖6；5-8F組和鼻咽癌患者組的外泌體處理巨噬細(xì)胞后的Bim蛋白顯著少于其他組(P<0.05)，見(jiàn)圖7。來(lái)自5-8F組外泌體中的miR-20a水平顯著高于NP69組(P<0.01)；由鼻咽癌患者組提取的外泌體中的miR-20a的水平顯著高于健康志愿者組(P<0.05)，見(jiàn)圖8。

圖4 巨噬細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取

a:P<0.05,與對(duì)照組、NP69組、健康志愿者組比較。

圖5 不同來(lái)源外泌體處理后各組巨噬細(xì)胞的凋亡指數(shù)

圖6 不同來(lái)源外泌體處理后各組巨噬細(xì)胞的 caspase-2蛋白表達(dá)

2.5 miR-20a擬似物及抑制物的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 與miR-20a抑似物對(duì)照組比較，miR-20a 擬似物組的凋亡指數(shù)顯著減少(P<0.01)；而相對(duì)于miR-20a抑制物對(duì)照組，抑制物組的凋亡指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖9。Bim蛋白：相對(duì)于miR-20a抑似物對(duì)照組，miR-20a 擬似物組的Bim蛋白水平顯著減少(P<0.05)；而相對(duì)于miR-20a抑制物對(duì)照組，抑制物組的Bim蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖10。cleaved caspase-9：相對(duì)于miR-20a抑似物對(duì)照組，miR-20a 擬似物組的cleaved caspase-9蛋白水平顯著減少(P<0.05)；而相對(duì)于miR-20a抑制物對(duì)照組，抑制物組的cleaved caspase-9蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖11。cleaved caspase-3：相對(duì)于miR-20a抑制物對(duì)照組，miR-20a擬似物組的cleaved caspase-3蛋白水平顯著減少(P<0.05)；而相對(duì)于miR-20a抑制物對(duì)照組，抑制物組的cleaved caspase-3蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖12。

a:P<0.05,與對(duì)照組、NP69組、健康志愿者組比較。

圖7 不同來(lái)源外泌體處理后各組巨噬

細(xì)胞的Bim蛋白表達(dá)

圖8 血清或培養(yǎng)基中分離的外泌體中miR-20a表達(dá)量(實(shí)時(shí)熒光定量PCR法)

圖9 miR-20a擬似物及抑制物轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后 的凋亡指數(shù)

圖10 miR-20a擬似物及抑制物轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后 Bim 蛋白水平

圖11 miR-20a擬似物及抑制物轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后 cleaved caspase-9蛋白水平

圖12 miR-20a擬似物及抑制物轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后 cleaved caspase-3蛋白水平

3 討 論

TAM是腫瘤微環(huán)境中重要的成分[8-9]。在本研究中，在鼻咽癌活檢組織中也查見(jiàn)大量TAM，說(shuō)明其可能參與了促鼻咽癌的作用。本研究前期從鼻咽癌患者血清和鼻咽癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中均分離出豐富的外泌體，原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞可以對(duì)這些外泌體吞噬，且隨后凋亡會(huì)受到抑制；因此考慮鼻咽癌外泌體可能通過(guò)其內(nèi)含的miRNA抑制了TAM的凋亡過(guò)程。外泌體是細(xì)胞來(lái)源的膜包被的微小囊泡，可以攜帶一系列的功能性分子如蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等。腫瘤來(lái)源的外泌體可以借助其內(nèi)含的miRNA對(duì)腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等進(jìn)行調(diào)節(jié)[10-12]。miRNA是一類非編碼單鏈小RNA分子，可以通過(guò)與靶基因mRNA的3′-UTR結(jié)合而在轉(zhuǎn)錄后水平沉默特定基因[13]。借助對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，本研究確定鼻咽癌細(xì)胞可能是借助外泌體中的miR-20a抑制了BCL2L11和(或)CASP2基因而參與抑制凋亡。本研究證實(shí)鼻咽癌細(xì)胞可以過(guò)表達(dá)miR-20a，而且可以經(jīng)過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移進(jìn)入巨噬細(xì)胞，進(jìn)而抑制其凋亡。對(duì)凋亡通路關(guān)鍵蛋白的定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-20a調(diào)控的靶基因是BCL2L11而非CASP2。分析得知：miR-20a和BCL2L11 mRNA的3′-UTR之間存在高度匹配的序列；miR-20a可以通過(guò)與之互補(bǔ)結(jié)合而抑制BCL2L11 mRNA的翻譯。BCL2L11基因編碼的Bim蛋白屬于Bcl-2家族一員，是促凋亡因子。Bim可以通過(guò)一些列過(guò)程最終募集并激活caspase-9，再由caspase-9激活caspase-3使細(xì)胞進(jìn)入凋亡[14]。miR-20a擬似物組的上述3種蛋白水平均顯著低于對(duì)照組，證明了過(guò)表達(dá)的miR-20a是通過(guò)抑制Bim-caspase-9-caspase-3途徑而抑制巨噬細(xì)胞凋亡的。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了鼻咽癌微環(huán)境中，癌細(xì)胞可以過(guò)表達(dá)miR-20a并通過(guò)外泌體將其傳遞到TAM而抑制其凋亡，機(jī)制是miR-20a抑制了Bim-caspase-9-casepase-3途徑的活化。因此，基于此發(fā)現(xiàn)可以設(shè)計(jì)新的抗腫瘤的研究或治療策略。

[1]Yoshizaki T,Ito M,Murono S,et al.Current understanding and management of nasopharyngeal carcinoma[J].Auris Nasus Larynx,2012,39(2):137-144.

[2]Kim J,Bae JS.Tumor-associated macrophages and neutrophils in tumor microenvironment[J].Mediators Inflamm,2016,2016:6058147.

[3]Duan Y,Li Z,Cheng S,et al.Nasopharyngeal carcinoma progression is mediated by EBER-triggered inflammation via the RIG-I pathway[J].Cancer Lett,2015,361(1):67-74.

[4]Shimakage M,Sakamoto H.Macrophage involvement in Epstein-Barr virus-related tumors[J].Exp Ther Med,2010,1(2):285-291.

[5]Ye SB,Li ZL,Luo DH,et al.Tumor-derived exosomes promote tumor progression and T-cell dysfunction through the regulation of enriched exosomal microRNAs in human nasopharyngeal carcinoma[J].Oncotarget,2014,5(14):5439-5452.

[6]Solinas G,Germano G,Mantovani A,et al.Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation[J].J Leukocyte Biol,2009,86(5):1065-1073.

[7]Lee JK,Park SR,Jung BK,et al.Exosomes derived from mesenchymal stem cells suppress angiogenesis by down-regulating VEGF expression in breast cancer cells[J].PLoS One,2013,8(12):e84256.

[8]Van Overmeire E,Laoui D,Keirsse J,et al.Mechanisms driving macrophage diversity and specialization in distinct tumor microenvironments and parallelisms with other tissues[J].Front Immunol,2014,5(3):127.

[9]Tu E,Chia PZ,Chen W.TGFβ in T cell biology and tumor immunity:angel or devil?[J].Cytokine Growth Factor Rev,2014,25(4):423-435.

[10]Simons M,Raposo G.Exosomes-vesicular carriers for intercellular communication[J].Curr OpinCell Biol,2009,21(4):575-581.

[11]Ohshima K,Inoue K,Fujiwara A,et al.Let-7 microRNA family is selectively secreted into the extracellular environment via exosomes in a metastatic gastric cancer cell line[J].PLoS One,2010,5(10):e13247.

[12]Hannafon BN,Ding WQ.Intercellular communication by exosome-derived microRNAs in cancer[J].Int J Mol Sci,2013,14(7):14240-14269.

[13]Bushati N,Cohen SM.microRNA functions [J].Annu Rev Cell Dev Biol,2007,23:175-205.

[14]Sionov RV,Vlahopoulos SA,Granot Z.Regulation of Bim in health and disease[J].Oncotarget,2015,6(27):23058-23134.

Exosome-derived miR-20a inhibit apoptosis of TAM by targeting BCL2L11 in nasopharyngeal carcinoma*

LvLonghui1,2,HuangXiaoque2,XiongXiaoming3,ZhangXu4,YangZhihui3,FangHongyan1,5△

(1.DepartmentofENT,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofENT,GeneralHospitalofChongqingIron&SteelGroupCompany,Chongqing400081,China;3.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;4.MorphologicalExperimentalCenter,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;5.DepartmentofENT,thePeople′sHospitalofChongqing,Chongqing400014,China)

Objective To investigate whether exosome-derived microRNA of nasopharyngeal carcinoma suppresses apoptosis of tumor associated macrophage (TAM).Methods Target microRNAs and genes were determined by bioinformatics methods.Isolated exosomes were used to detect miR-20a expression by qRT-PCR.Furthermore,apoptosis index and proteins involved in apoptotic pathways were detected after miR-20a mimic and inhibitor transfection into macrophages.Results miR-20a expression was up-regulated in isolated exosomes.miR-20a target gene was BCL2L11.MiR-20a overexpression could inhibit apoptosis of macrophages,meanwhile,apoptotic pathways related proteins Bim,caspase-9 and caspase-3 were significantly suppressed by miR-20a mimic(P<0.05).Conclusion miR-20a can suppress activation of Bim-caspase-9-casepase-3 and resulting in apoptotic inhibition of macrophages.

nasopharyngeal neoplasms;exosome;miR-20a;BCL2L11;macrophages

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.001

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81101679)；四川省科技廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(14JC0178)。

呂龍輝(1980-)，在讀碩士，主治醫(yī)師，主要從事鼻竇炎及鼻咽癌方面的研究?！?/p>

，E-mail:emelyhui@163.com。

R766.3

A

1671-8348(2017)06-0721-04

2016-10-24

2016-11-22)