李瑩，艾士奇，曹文悅，王海鵬，熊志強(qiáng)，王國興，王偉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

木質(zhì)素分解復(fù)合菌系LDC的分解特性與細(xì)菌組成多樣性

李瑩，艾士奇，曹文悅，王海鵬，熊志強(qiáng)，王國興，王偉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

利用細(xì)菌復(fù)合菌系LDC對木質(zhì)纖維素進(jìn)行生物處理，研究其分解及產(chǎn)酶特性、細(xì)菌組成多樣性，為秸稈類木質(zhì)纖維素資源的生物利用提供依據(jù)。用范氏纖維素測定方法測定復(fù)合菌系LDC在降解蘆葦?shù)倪^程中木質(zhì)纖維素含量變化，同時檢測分解過程中的發(fā)酵液的pH及酶活力變化趨勢；運用高通量技術(shù)對LDC的16SrDNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行測序，分析其細(xì)菌組成多樣性。LDC具有較強(qiáng)的木質(zhì)素、半纖維素分解能力，而很少分解纖維素；LDC能夠分泌木質(zhì)素降解酶，漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶的最大酶活分別為136.7、1 206.5、3 933.3 U·L-1。LDC秸稈周圍的液態(tài)培養(yǎng)物（S1）及LDC處理后的秸稈表面（S2）兩個樣品的細(xì)菌組成沒有差異、菌屬組成豐度存在很大差異。S1中相對量最高的優(yōu)勢菌屬為索氏菌屬（Thauera，22.32%）；S2中相對量最高的優(yōu)勢菌屬為：假單胞菌屬（Pseudomonas，26.99%）。LDC不分解纖維素且具有較高效的木質(zhì)素分解能力，對研究木質(zhì)素的生物降解具有非常重要的意義。

木質(zhì)素分解；復(fù)合菌系；木質(zhì)素降解酶；多樣性

木質(zhì)素是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜、廣泛存在于植物中的高分子化合物，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分，是由苯基丙烷結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的具有三維空間結(jié)構(gòu)的高分子芳香族聚合物[1]，是難降解的有機(jī)化合物，木質(zhì)素的預(yù)處理是木質(zhì)纖維素利用的主要瓶頸[2]，其在自然界的徹底礦化需要真菌、細(xì)菌及相應(yīng)微生物群落的共同作用。真菌降解木質(zhì)素能力強(qiáng)，研究結(jié)果多且較深入[3]，但是生產(chǎn)上應(yīng)用規(guī)模不大。細(xì)菌來源廣泛、生長快速、對環(huán)境變化耐受性強(qiáng)易大規(guī)模應(yīng)用[4-5]，但是，目前關(guān)于細(xì)菌對木質(zhì)素分解的報道較少。已有研究表明，木質(zhì)素分解酶類產(chǎn)生于細(xì)菌生長的初級代謝階段，細(xì)菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）和漆酶（Lac）能力較真菌弱[7]，細(xì)菌分解木質(zhì)素的研究主要集中在單一細(xì)菌菌株對木質(zhì)素的分解途徑方面；單一菌株對木質(zhì)纖維素的分解效果沒有多種細(xì)菌菌株協(xié)同分解的作用強(qiáng)，復(fù)合菌系對木質(zhì)纖維素的分解效果遠(yuǎn)高于單一菌株[8-9]。因此，如何利用微生物復(fù)合菌系組分之間的協(xié)同作用高效分解木質(zhì)素并分析其分解機(jī)理具有重要意義。

試驗以實驗室自己組建的木質(zhì)素分解復(fù)合菌系LDC為研究對象，運用高通量測序技術(shù)分析其微生物組成多樣性，研究復(fù)合菌系分解木質(zhì)素的特性，為開發(fā)分解木質(zhì)素微生物資源提供新的方法，為研究復(fù)合菌系分解木質(zhì)素機(jī)理提供前期基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

試驗自行篩選的木質(zhì)素分解復(fù)合菌系，命名為LDC[10]。

1.2 培養(yǎng)基

MSM培養(yǎng)基：NaNO32.5 g；KH2PO41.0 g；NaCl 0.5 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；CaCl20.1 g；微量元素混合液1 mL；蒸餾水1 000 mL，pH為8.3，添加蘆葦2%（W/V），1×105Pa滅菌30 min后，冷卻后待用。

微量元素混合液（g·L-1）：FeCl3·6H2O 0.16 g；Zn SO4·7H2O 1.5 g；CoCl2·6H2O 0.16 g；CuSO4·5H2O 0.15 g；MnSO4·H2O 1.5 g；H3BO30.3 g；Na2MoO4·2H2O 0.1 g。

蘆葦：試驗所用蘆葦均采自黑龍江大慶市蘆葦濕地秋季成熟蘆葦，經(jīng)3%NaOH浸泡處理24 h，沖洗至pH為7，80℃烘干備用。

1.3 試驗方法

將復(fù)合系LDC接種到50 mL的MSM培養(yǎng)基中，接種量為10%（v/v），30℃恒溫靜置培養(yǎng)，于接種后的0～15 d每天定時取適量的液態(tài)培養(yǎng)物，檢測其pH變化規(guī)律、測定木質(zhì)纖維素含量，測定漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶酶活每個處理重復(fù)3次，在接種后第5 d取樣采用高通量測序方法測定細(xì)菌多樣性。

1.4 參數(shù)測定

1.4.1 pH測定

用HORIBA-212型酸度計（日本）檢測培養(yǎng)體系的pH。

1.4.2 木質(zhì)纖維素含量的測定

用ANKOM220半自動纖維素測定儀（USA）測定蘆葦中的木質(zhì)纖維素，測定方法[10]參照范氏纖維素測定法。

1.4.3 酶活的測定

復(fù)合系LDC接種后的1～15 d每天定時取適量的液態(tài)培養(yǎng)物離心（12 000 r·min-1，10 min），離心所得上清液為待測的粗酶液。漆酶（Lac）：采用ABTS法[11]，一個酶活單位（U）定義為每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量；木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）：采用藜蘆醇法[12]，一個酶活力單位（U）定義為每分鐘氧化藜蘆醇產(chǎn)生1 μmol藜蘆醛所需的酶量；錳過氧化物酶（MnP）[13]；一個酶活力單位（U）定義為每分鐘氧化Mn2+產(chǎn)生1 μmol Mn3+所需的酶量。

1.4.4 高通量測序

1.4.4.1 測序樣品采集

S1：LDC培養(yǎng)第5 d液態(tài)培養(yǎng)物

S2：LDC處理后的蘆葦秸稈：取10 gLDC處理第5 d的蘆葦秸稈，用適量的PBS沖洗秸稈表面，3 000 r·min-1離心10 min后將秸稈取出后，置于50 mL錐形瓶中，加入100 mL PBS，200 r·min-1振蕩60 min，40 KHz超聲5 min，再200 r·min-1振蕩60 min；取上清液到50 mL離心管，先15 000 r·min-1離心1 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個50 mL離心管中，12 000 r·min-1離心10 min得菌體[14]。

1.4.4.2 總DNA的提取

分別取適量的S1，S2，用氯化芐法提取其總DNA[15]。

1.4.4.3 16srDNA基因V3-V4區(qū)PCR擴(kuò)增及測序

提取樣品總DNA后，根據(jù)細(xì)菌V3+V4區(qū)設(shè)計得到引物，合并引物接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina MiSeq PE300進(jìn)行測序[16]。

1.4.4.4 細(xì)菌多樣性數(shù)據(jù)分析

對序列進(jìn)行聚類，將97%相似性的序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units）。按眾數(shù)原則對序列進(jìn)行注釋，對序列進(jìn)行物種注釋。統(tǒng)計每個樣品在各分類水平上的構(gòu)成，用柱狀圖進(jìn)行可視化。統(tǒng)計每個樣品中在屬分類水平上的菌群做聚類，用相同顏色表示該屬類所含的OTU序列豐度的相對高低[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌系LDC的分解特性

2.1.1 LDC分解過程中蘆葦中木質(zhì)纖維素含量的變化

圖1顯示了LDC利用蘆葦秸稈為唯一碳源的培養(yǎng)過程中，對纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的分解情況。

LDC主要分解蘆葦中木質(zhì)素、半纖維素，且分解主要發(fā)生在培養(yǎng)的前3 d，在第2天時，半纖維素的分解率為32.3%，第3 d時木質(zhì)素分解量分別為59.9%，最終木質(zhì)素和半纖維素分解率分別達(dá)到60.9%和43.0%。而在培養(yǎng)的過程中纖維素分解率極低，最終為2.0%。

圖1 LDC分解過程中蘆葦中木質(zhì)纖維素含量變化規(guī)律Fig.1The variation rule of ligncellulose contents during reeds decomposed process by LDC culturing

2.1.2 LDC分解過程中體系的pH變化規(guī)律

培養(yǎng)基初始pH以及發(fā)酵過程中pH控制是發(fā)酵成功與否的關(guān)鍵，堿性條件下有利于細(xì)菌對木質(zhì)素的分解[17-18]。在LDC接種后體系內(nèi)pH呈先下降后上升趨勢，接種后1 d培養(yǎng)體系的pH下降到6.9，第3天回升至7.7，隨后回升趨勢緩慢，在培養(yǎng)的11 d，維持pH為8.3不變，與培養(yǎng)基初始pH相同。LDC分解木質(zhì)素、半纖維素的產(chǎn)物為酸性物質(zhì)，所以體系的pH在培養(yǎng)的前2 d迅速降低，隨著木素分解情況趨于平緩，其體系內(nèi)的pH逐漸恢復(fù)至初始水平。王偉東等[19]在研究木質(zhì)纖維素分解復(fù)合菌系WSC-6培養(yǎng)過程中pH的變化時發(fā)現(xiàn)，WSC-6在分解稻桿過程中，培養(yǎng)體系內(nèi)的pH在培養(yǎng)的第3天由初始pH為7.8降至6.0，而后恢復(fù)至8.0，說明菌系內(nèi)多菌株之間協(xié)同作用可以調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的pH并有利于微生物發(fā)揮作用。

圖2 LDC分解木質(zhì)纖維素過程中體系pH的變化Fig.2The variation of pH during reeds decomposed process by LDC culturing

2.2 LDC分解蘆葦過程中酶活性的變化

已有的報道中，最主要、最有效的木質(zhì)素降解酶分別為：漆酶（Lac）、錳過氧化物酶（MnP）、木質(zhì)素過氧化物酶（LiP），這三種酶共同構(gòu)成白腐菌的木質(zhì)素降解酶系[20]。研究表明細(xì)菌也能產(chǎn)生以上三種酶對木質(zhì)素進(jìn)行降解[21]，但分解木質(zhì)素的細(xì)菌的研究相對較少。圖3結(jié)果表明，LDC在降解蘆葦中的木質(zhì)素的過程中也能產(chǎn)生與真菌類似的3種木質(zhì)素降解酶，整個分解周期漆酶的活力較低，僅在第1天達(dá)到136.7 U·L-1，隨后快速下降直到培養(yǎng)末期都維持在40.0 U·L-1左右；錳過氧化物酶以及木質(zhì)素過氧化物酶的活力較高且變化趨勢也相似，在分解的第1天錳過氧化物酶以及木質(zhì)素過氧化物酶的活力分別為3 451.9 U·L-1和1 206.5 U·L-1，分別在分解的第2天下降至最低值，從分解的第3天開始兩種酶的活力均開始回升，并且錳化物過氧化物酶的活力在第3天達(dá)到最大值3 933.3 U·L-1，之后隨著分解的進(jìn)行直到培養(yǎng)的末期酶活力的變化趨于平緩。

圖3 LDC分解木質(zhì)纖維素過程中產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的變化Fig.3The variation of ligninolytic enzyme during reeds decomposed process by LDC

2.3 LDC細(xì)菌組成多樣性分析

對S1、S2高通量測序后共獲得有效序列98 180條，按相似度97%進(jìn)行聚類分析，2個樣品一共獲得122個OUTs。其中S1獲得43 233條序列（118個 OTUs），S2獲得54 947條序列（119個OTUs），S1和S2共有115個OTUs，S1和S2樣品細(xì)菌組成在屬的水平上比較豐富。在97%相似度水平下，各樣品Alpha多樣性指數(shù)值統(tǒng)計如表1所示：

表1 S1、S2細(xì)菌組成豐度和多樣性指數(shù)Table 1Richness and diversity index of bacterial community for S1，S2

在門的分類水平上對相對豐度統(tǒng)計結(jié)果為：擬桿菌門（Bacteroidetes）S1：28.38%，S2：38.93%；厚壁菌門（Firmicutes）S1：12.07%，S2：13.56%；變形菌門（Proteobacteria）S1：57.39%，S2：46.75%。S1和S2樣品細(xì)菌組成在屬的水平上包含92個屬的細(xì)菌，相對豐度高于1%的可分類菌屬共有17個，將屬的分類水平上的菌群結(jié)構(gòu)的組成繪制成柱狀圖（圖4）。S1中相對量較高的占優(yōu)勢的菌屬為索氏菌屬（Thauera，22.32%）；假單胞菌屬（Pseudomonas，8.80%）；Proteiniphilum，5.56%；脫硫微菌屬（Desulfomicrobium，4.36%）。S2中相對量較高的占優(yōu)勢的菌屬為：假單胞菌屬（Pseudomonas，26.99%）；固氮螺菌屬（Azospirillum，4.61%）；索氏菌屬（Thauera，3.99%）。

圖4 S1和S2在屬的分類水平上物種分布柱狀圖Fig.4Bacteria composition and relative abundance at genus level of S1 and S2

3 討論

由于木質(zhì)素是難降解的有機(jī)化合物，是生物制漿、乙醇生物轉(zhuǎn)化等纖維素資源利用及木質(zhì)素污染的環(huán)境治理的主要屏障，以限制性培養(yǎng)法篩選出的一組木質(zhì)素分解復(fù)合菌系LDC，其對蘆葦秸稈的分解主要發(fā)生在培養(yǎng)的前3 d，不但能夠去除木質(zhì)素而且能夠保留秸稈中的纖維素很少被分解。木質(zhì)素的分解需要其他碳源和能源來提供微生物的生長和代謝，王宏勛等[22]在研究木質(zhì)纖維素降解規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，在秸稈在分解過程中先將其小分子碳源和半纖維素降解為小分子酸類和酯類，再降解半纖維素，最后降解木質(zhì)素。LDC分解過程中發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素分解的同時也伴隨著半纖維素的分解，在LDC的培養(yǎng)過程中半纖維素分解主要在培養(yǎng)的前3 d，最終分解率高達(dá)43.0%；復(fù)合系LDC中與半纖維的分解相關(guān)的菌屬為類芽孢桿菌屬，此細(xì)菌能夠產(chǎn)生木聚糖酶[23]，由于禾本科植物秸稈的半纖維素結(jié)構(gòu)主要是木聚糖，半纖維素可以被微生物分泌胞外酶降解，釋放木糖和其他單糖[24]。半纖維素降解產(chǎn)生的糖類可以為體系中的微生物提供生長代謝的能源，有利于難降解的木質(zhì)素進(jìn)行分解。

細(xì)菌對木質(zhì)素的降解主要在其生長的初級代謝階段，細(xì)菌產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶，使木質(zhì)素在分解的初期發(fā)生改性，目前對細(xì)菌來源的木質(zhì)素降解酶的種類、結(jié)構(gòu)、機(jī)制尚不明確，但有大量研究表明細(xì)菌也可以分泌漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶三種酶[21]。LDC在分解過程中監(jiān)測產(chǎn)這三種酶情況發(fā)現(xiàn)，LDC產(chǎn)漆酶的能力很差，而木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶的活力在整個分解過程中都保持很高的活性且酶活力高于已報道的能夠降解木質(zhì)素的單個純菌株[25]，證明LDC是主要產(chǎn)過氧化物酶的。反常的是這三種酶的活力在第1 d就達(dá)到較高水平后沒有維持下去而是在第2 d下降到了最低值，這可能是體系的pH的變化導(dǎo)致的?？踪坏妊芯堪l(fā)現(xiàn)高pH利于堿性木質(zhì)素的分解[17]，而LDC體系的pH值在培養(yǎng)1 d后由初始的8.3下降到6.9，pH值的變化對微生物的活動有較大的影響，適宜的pH有利于菌體生長，木質(zhì)素的分解，同時也影響酶的合成、酶活力的大小[26]。

木質(zhì)素分解是由不同種類的微生物共同作用完成的，目前關(guān)于細(xì)菌分解木質(zhì)素的研究都是針對純培養(yǎng)菌株展開的，但是對細(xì)菌復(fù)合菌系對木質(zhì)素分解的研究幾乎沒有，試驗通過對S1及S2的高通量測序技術(shù)分析木質(zhì)素復(fù)合分解菌系LDC的細(xì)菌組成與多樣性。高通量測序技術(shù)相比于傳統(tǒng)的分子生物學(xué)手段更加全面、準(zhǔn)確，可以揭示不同種類的細(xì)菌在木質(zhì)素分解過程中的功能，分析不同菌種之間存在的協(xié)同關(guān)系。從對液態(tài)培養(yǎng)物S1及秸稈表面S2的組成多樣性分析來看，兩個樣品的各菌屬組成一致但豐度存在很大差異，同一體系中不同基質(zhì)上的細(xì)菌豐度存在差異，可能是不同菌屬的功能造成了分布的不同。S1、S2相對量較高的占優(yōu)勢的菌屬為索氏菌屬、假單胞菌屬、Proteiniphilum、脫硫微菌屬、固氮螺菌屬。

假單胞菌屬可以分解木質(zhì)素以及芳香族化合物，且被認(rèn)為是細(xì)菌中分解木質(zhì)素作用最強(qiáng)的微生物[27-28]，可以分解分子量從大到小、聚合度從高到低的木質(zhì)素或芳香族化合物，在S2中所占的比例最大為26.99%，為LDC分解木質(zhì)素的關(guān)鍵菌群。固氮弓菌屬與索氏菌屬均具有分解如苯酚類低聚合芳香族化合物的能力[27]，可能具有分解分子量較小、聚合度較低的木質(zhì)素或芳香族化合物的作用，且索氏菌屬在S1中所占的比例高達(dá)22.32%，推測其在木素分解的過程中代謝大分子木質(zhì)素分解的中間產(chǎn)物。Proteiniphilum與脫硫微菌屬均為嚴(yán)格厭氧菌，Proteiniphilum屬于擬桿菌門，其近緣種是在廢水反應(yīng)器中分離得到的，是一種產(chǎn)氫產(chǎn)甲烷菌共生的烴類降解菌[29]，在體系中能夠協(xié)同參與大分子木質(zhì)素的降解。脫硫微菌屬是少數(shù)能夠降解木質(zhì)素的厭氧菌之一[21]，其能夠利用硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽作為其自身的電子受體產(chǎn)生硫化氫。未培養(yǎng)細(xì)菌：所占比例極大，因此其在木質(zhì)纖維素的分解的過程起的作用較大，而其具體為何種細(xì)菌、在LDC體系中的作用都有待于進(jìn)一步研究。

微生物復(fù)合菌系對木質(zhì)纖維素的分解效果遠(yuǎn)高于單一菌株[31]，說明多種細(xì)菌協(xié)同作用是木質(zhì)纖維素高效分解的關(guān)鍵，也符合自然狀態(tài)下物質(zhì)的分解規(guī)律。

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Decompostion Characterization and Diversity of Bacterial Composition of Lignin Deragdation Community LDC

Li Ying，Ai Shiqing，Cao Wenyue，Wang Haipeng，Xiong Zhiqiang，Wang Guoxing，Wang Weidong
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to better use the compound bacteria strains LDC to treat lignocellulose resources，it was important to research its characteristics of decomposition，producing enzyme and the diversity of bacteria composition.The change of lignocellulose content during the process of reed degradation with LDC was detected by using the Fann cellulose determination method.The change tendency of pH and enzyme activity of fermentation liquid in the process of reed degradation was detected.The V3-V4 region of 16SrDNA gene of LDC was sequenced by using high throughput technology to analyze the diversity of bacteria composition.The LDC had strong ability of lignin and hemicellulose decomposition，but weak ability of cellulose decomposition.The LDC could secrete lignin degradation enzymes and the maximal enzyme activity of laccase，lignin peroxidase and manganese peroxidase was 136.7，1 206.5 and 3 933.3 U·L-1respectively.There was no difference in the bacteria composition of the two samples consisting liquid cultures（S1）and the surface of straw treated by LDC（S2）.However，there was a big difference in the composition abundance of bacteria genus both S1 and S2.The dominant bacterium of the highest relative amount was Thauera in the S1（Thauera，22.32%）. The dominant bacterium of the highest relative amount was Pseudomonas in the S2（Pseudomonas，26.99%）.The LDC had very important significance for the study of lignin biodegradation in cellulose decomposition with high efficiency.

lignin degradation；bacterial community；lignocellulolytic enzymes；diversity of bacterial composition

Q939

A

1002-2090（2017）01-0083-06

2015-11-12

國家科技支撐計劃（2015BAD21B04，2012BAD12B05-3）；黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊項目（2012TD006）；黑龍江農(nóng)墾總局攻關(guān)項目（HNK125B-11-06A，HNK125B-11-11A）。

李瑩（1990-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2013級碩士研究生。

王偉東，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：wwdccy@126.com。