王晚霞，蔡劍平

（1.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.北京醫(yī)院/國家老年醫(yī)學(xué)中心/衛(wèi)計(jì)委老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730）

胰島素變異的病理效應(yīng)綜述

王晚霞1，2，蔡劍平2*

（1.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.北京醫(yī)院/國家老年醫(yī)學(xué)中心/衛(wèi)計(jì)委老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730）

胰島素及其前體胰島素原功能和結(jié)構(gòu)異常是發(fā)生糖尿病的原因之一。人胰島素基因變異影響胰島素合成的各個(gè)環(huán)節(jié)，已經(jīng)被確定為新生兒糖尿病、青少年早發(fā)性糖尿病、自身抗體陰性1型糖尿病和早發(fā)性2型糖尿病的病因。前胰島素原突變可以引起糖尿病、高胰島素血癥和高胰島素原血癥，其機(jī)制主要與胰島素原錯(cuò)誤折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及胰島B細(xì)胞凋亡有關(guān)。

胰島素；糖尿??；基因變異

胰島素及其前體胰島素原功能和結(jié)構(gòu)異常是發(fā)生糖尿病的原因之一。胰島素變異影響其與受體結(jié)合或其高爾基體進(jìn)一步成熟，導(dǎo)致非高血糖血清胰島素、胰島素原或胰島素原裂解物升高。變異還通過影響胰島素內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成熟，導(dǎo)致胰島B細(xì)胞凋亡、減少。近年來，隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，越來越多的胰島素變異位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，胰島素變異在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視。

1 胰島素基因變異的病理效應(yīng)

1.1 影響胰島素基因轉(zhuǎn)錄和翻譯

胰島B細(xì)胞合成胰島素時(shí)，胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯均受嚴(yán)格的調(diào)控，而參與胰島素基因表達(dá)的非編碼區(qū)基因突變常會(huì)影響胰島素的合成。已發(fā)現(xiàn)影響胰島素基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的12種非編碼區(qū)基因突變?yōu)殡[性遺傳[1-2]，其中5種位于胰島素基因啟動(dòng)子區(qū)，導(dǎo)致啟動(dòng)子區(qū)缺失或DNA與調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)丟失，90%的突變都會(huì)下調(diào)啟動(dòng)子的活性[2]。與糖尿病有關(guān)的非編碼區(qū)基因突變有：缺失型（c.-366_-343del，c.-370-_186+del，c. -65_581del）、啟動(dòng)子區(qū)（c.-331 C＞A/G，c.-332C＞G+c.-331 C＞G，c.-218 A＞C）、3’UTR（c.*59 A＞G）、翻譯起始區(qū)（c.3G＞T，c.3G＞A）和提前終止型[c.184C＞T（Q62X）][2]。

1.2 影響前胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位和移位

前胰島素原包含一個(gè)疏水性的N-末端的信號(hào)肽，胰島B細(xì)胞中，前胰島素原信號(hào)肽的斷裂觸發(fā)胰島素原單體的折疊[3]。前胰島素原信號(hào)肽N或C末端突變易影響胰島素原合成4個(gè)早期事件，即遷移的完成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic Reticulum，ER）信號(hào)肽酶催化的信號(hào)肽切除、觸發(fā)B鏈折疊和觸發(fā)二硫鍵的形成[4]。目前信號(hào)肽部分與糖尿病有關(guān)的胰島素變異有4種，即R6C、R6H、L13R、A24D[5-7]。L13R和A24D變異常導(dǎo)致較為嚴(yán)重的新生兒永久性糖尿病，而R6C和R6H變異常表現(xiàn)為病情相對(duì)新生兒永久性糖尿病較輕的青少年早發(fā)性糖尿病，表明這些變異誘發(fā)糖尿病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制不同。

1.3 影響胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊

胰島素原在多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的分子伴侶蛋白作用下進(jìn)一步折疊，并形成3個(gè)二硫鍵。據(jù)預(yù)測(cè)，約70%致前胰島素原氨基酸變異的基因突變會(huì)影響胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的正常折疊，其中一半以上已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。由于半胱氨酸對(duì)二硫鍵的形成至關(guān)重要，變異的氨基酸以有無涉及半胱氨酸的形成可分為兩大類，然而這些變異均通過干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)二硫鍵的形成阻礙胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊。涉及半胱氨酸的變異有C31Y、C43G、F48C、R55C、G84R、R89C、G90C、C95S、S101C、C96Y/S/R、Y103C、Y108C/X、C109F/Y/R，其中C96Y和C95S變異不僅可以見于人MIDY綜合征，也可見于鼠類糖尿病模型，受到研究者廣泛關(guān)注[8]。研究證實(shí)，這些變異擾亂了通過改變半胱氨酸或產(chǎn)生新的半胱氨酸干擾正常二硫鍵的形成，阻礙了后續(xù)的折疊步驟。例如體外表達(dá)突變體胰島素原C96Y能改變野生型胰島素原在ER中的穩(wěn)態(tài)分布，影響B(tài)細(xì)胞功能[9]。與半胱氨酸無關(guān)但同樣會(huì)影響胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊的變異有H29D、L30M/P/ V/Q、G32R/S、L35P、R46Q、L39Y40delinsH、G47V[6，8，10-12]，這些變異阻礙胰島素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)正確形成二硫鍵，往往產(chǎn)生錯(cuò)配的二硫鍵，擾亂了胰島素原的正常折疊。

1.4 影響胰島素原的轉(zhuǎn)運(yùn)和成熟

正確折疊的胰島素原將由ER進(jìn)入高爾基體，兩個(gè)內(nèi)切蛋白酶PC1和PC2與外肽酶CPH協(xié)同作用，使胰島素原轉(zhuǎn)換為胰島素。PC1裂解人胰島素原B鏈/C鏈連接處羧基端Arg31和 Arg32，而PC2裂解A鏈/C鏈連接處Lys64和Arg65。CPH的主要作用是移除PC1和PC2作用后殘留的堿性氨基酸，加速轉(zhuǎn)換過程。

目前已發(fā)現(xiàn)的B鏈-C肽和C肽-A鏈交界處的胰島素基因突變有5種。C肽-A鏈交界處的精氨酸可以被亮氨酸、組氨酸或脯氨酸取代，導(dǎo)致高胰島素原血癥、臨界性糖耐量異?；蜻t發(fā)性糖尿病。相反，B鏈-C肽和C肽-A鏈交界處的精氨酸被半胱氨酸取代后則導(dǎo)致早發(fā)胰島素缺乏型重度糖尿病。比較R89L和R89C變異發(fā)現(xiàn)，R89L變異時(shí)細(xì)胞可以分泌胰島素原，而R89C變異可以導(dǎo)致胰島素原錯(cuò)誤折疊并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)滯留?？梢姡@些變異所致的臨床表現(xiàn)因剪接位點(diǎn)取代氨基酸的不同而不同。胰島素原B鏈-C肽交界處R55C突變的患者C肽水平正常，胰島素缺乏嚴(yán)重，尚不清楚胰島素嚴(yán)重缺乏的原因。將R55C變異型轉(zhuǎn)入MIN6細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，變異胰島素R55C通常位于分泌顆粒，造成ER應(yīng)激和MIN6細(xì)胞減少[6]。

1.5 影響胰島素與受體的結(jié)合能力

影響胰島素和受體結(jié)合的氨基酸很多，主要是A鏈氨基末端和B鏈羧基末端區(qū)域的氨基酸。這些氨基酸的變異會(huì)導(dǎo)致胰島素二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變，影響胰島素的穩(wěn)定性及胰島素與受體的親和力。

關(guān)于B鏈結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的研究最多，特別是B鏈的羧基末端。去除HisB5急劇降低胰島素與受體結(jié)合活性，僅保留15%。LeuB6缺失變異將使胰島素與受體的結(jié)合能力不足1%。HisB10對(duì)維持胰島素的最大活性非常重要，當(dāng)其被AspB10替代時(shí)，胰島素原將不能轉(zhuǎn)換為胰島素，導(dǎo)致循環(huán)中胰島素原增加。B鏈羧基末端一些進(jìn)化上比較保守的氨基酸對(duì)胰島素與受體的親和力非常重要，包括 GlyB23、PheB24、PheB25和TyrB26，其中PheB24形成的氫鍵對(duì)二聚體形成至關(guān)重要。曾有研究發(fā)現(xiàn)，用其他氨基酸取代PheB24后，胰島素活性顯著下降。SerB24胰島素類似物活性約為胰島素活性的7%～15%，LeuB24胰島素類似物活性約為胰島素活性的10%～50%。最近，Zakova等[13]研究發(fā)現(xiàn)，用L型其他氨基酸替代PheB24，胰島素生物活性和親和力顯著下降，非芳香族氨基酸LeuB24、SerB24和AlaB24胰島素類似物親和力多不超過20%，用甘氨酸取代PheB24，其親和力約為22%～78%?？傊?，胰島素單體這些區(qū)域?qū)ζ渑c受體的結(jié)合非常重要，去除或替代這些區(qū)域氨基酸的胰島素類似物與受體結(jié)合或激活受體的能力下降。

2 胰島素變異與疾病

胰島素基因突變可以引起糖尿病、高胰島素血癥和高胰島素原血癥，其機(jī)制主要與胰島素原錯(cuò)誤折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及胰島B細(xì)胞凋亡有關(guān)。

2.1 糖尿病

早期研究認(rèn)為，胰島素基因突變引起糖尿病的可能性很小，因?yàn)橐葝u素基因突變較為罕見，不是致病的重要因素。然而，近幾年有研究表明，胰島素基因突變不僅是新生兒永久性糖尿?。≒ermanent Neonatal Diabetes Mellitus，PNDM）的常見原因，也能導(dǎo)致青少年早發(fā)性糖尿?。∕aturity-Onset Diabetes of the Young，MODY）。此外，胰島素基因變異是產(chǎn)生Akita和Munich糖尿病鼠的主要原因。

與糖尿病相關(guān)的前胰島素原突變涉及19個(gè)氨基酸，包括23種錯(cuò)義突變、1種無義突變和1種插入缺失突變，它們分布在前胰島素原C肽外所有區(qū)域：信號(hào)肽（2個(gè)）、B鏈（12個(gè)）、A鏈（8個(gè)）及C肽側(cè)面成對(duì)的堿性氨基酸（2個(gè)）。C肽側(cè)面堿性氨基酸位于B鏈-C肽（R55C）和A鏈-C肽（R89C）的酶切位點(diǎn)。到目前為止，其中13種突變出現(xiàn)超過1個(gè)先證者；5個(gè)密碼子突變（A24D、G32S/R、F48C、R89C和C96Y/S）占所有突變的56%；6個(gè)殘基被不同的氨基酸替代：R6C/H、A23S/T、L30M/P/V、G32S/R、C96Y/S和Y108C/X。有5種突變（R6C、R6H、L30M、R46Q和R55C）見于非新生兒期或嬰兒期糖尿病，表明這些變異對(duì)胰島B細(xì)胞有不同效應(yīng)[14]。

2.2 家族性高胰島素血癥

胰島素變異后產(chǎn)生的效應(yīng)是多樣的，并不是所有的胰島素基因變異都與糖尿病有關(guān)，相反，胰島素有些位點(diǎn)氨基酸變異后僅僅表現(xiàn)為高胰島素血癥，而B鏈10位天門冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸的胰島素類似物，發(fā)現(xiàn)該胰島素類似物活性超強(qiáng)，與胰島素受體的結(jié)合能力極強(qiáng)。引起高胰島素血癥的變異尚未引起廣泛關(guān)注，其實(shí)探索高胰島素血癥的原因同樣有利于闡明2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制。Banting科學(xué)成就獎(jiǎng)獲得者Corkey提出[15-16]，2型糖尿病的先決原因是高胰島素血癥，而胰島素抵抗是其后的代償。

B鏈10位天門冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸的胰島素變異相繼被發(fā)現(xiàn)。高胰島素血癥（His-B10-Asp）轉(zhuǎn)基因小鼠模型也證實(shí)高胰島素血癥的小鼠胰島Langerhans細(xì)胞中突變的激素原水平極高，這可能是胰島通過不受調(diào)節(jié)旁路持續(xù)分泌突變酶原的結(jié)果。前胰島素原89位精氨酸是胰島素原轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素所必需的，研究發(fā)現(xiàn)，這一位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸、亮氨酸、脯氨酸后，均表現(xiàn)為高胰島素血癥。

3 結(jié)語

胰島素缺乏和胰島素作用障礙是糖尿病的主要特征，確定引起單基因糖尿病的特定基因變異不僅有利于個(gè)體化治療，更有助于我們理解胰島B細(xì)胞的生理，為更好地了解糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供了重要信息。2型糖尿病中胰島素基因變異罕見，其RNA和蛋白質(zhì)水平是否存在這些相似的變異尚不清楚，可進(jìn)一步從RNA或蛋白質(zhì)水平尋找這些異常胰島素，這有助于闡明糖尿病的發(fā)病機(jī)制。

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（*通訊作者：蔡劍平）

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