夏春輝，王玉，陳宇航，孫東升，付雙，李紅梅

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006

MTT法檢測(cè)異咯嗪光動(dòng)力對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制作用

夏春輝，王玉，陳宇航，孫東升，付雙，李紅梅

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006

目的研究異咯嗪光動(dòng)力對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制作用。方法采用四甲基偶氮唑藍(lán)染色法(MTT法)測(cè)定異咯嗪光動(dòng)力對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果異咯嗪光動(dòng)力能明顯抑制Bel-7402細(xì)胞。結(jié)論異咯嗪是一種很有潛力抗癌光敏劑。

異咯嗪；光動(dòng)力；凋亡；Bel-7402細(xì)胞

腫瘤光動(dòng)力治療(photodynamic therapy)是一種新型的治療腫瘤技術(shù)。該技術(shù)是基于特定波長(zhǎng)的光激發(fā)腫瘤細(xì)胞攝入的光敏劑，生成活性很強(qiáng)的活性氧，從而殺死腫瘤細(xì)胞[1-3]。光敏劑是光動(dòng)力治療的關(guān)鍵。由于異咯嗪毒副作用小，表現(xiàn)出較強(qiáng)的光敏特性，因而它可能是很有前途的抗腫瘤光敏劑[4-6]。該文采用四甲基偶氮唑藍(lán)染色法(MTT染色法)研究了異咯嗪（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1）光動(dòng)力對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制作用，以期為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料

異咯嗪與MTT為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基Gibco公司產(chǎn)品；牛血清為PAA公司產(chǎn)品；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；Bel-7402人肝癌細(xì)胞為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

1.2 儀器及設(shè)備

VS-1300L-U凈化工作臺(tái)；3111二氧化碳培養(yǎng)箱；SB-100P黑光燈；DSZ－5000X倒置生物顯微鏡，680全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

在37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，Bel-7402人肝癌細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基（鏈霉素與青霉素的終濃度為100 mg/L）培養(yǎng)。

1.4 MTT染色法測(cè)定異咯嗪光動(dòng)力對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，調(diào)整濃度約為4×104個(gè)/mL，然后接種于96孔培養(yǎng)板中。在培養(yǎng)孔中加入濃度為4 μg/mL的異咯嗪新培養(yǎng)液，用SB-100P燈照射60 min。在37℃下加入PBS配制的MTT溶液（5 g/L），培養(yǎng)4 h，在倒置顯微鏡下觀(guān)察經(jīng)異咯嗪光動(dòng)力作用后的細(xì)胞。吸取上清，加入200 μL DMSO，在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。然后根據(jù)公式：細(xì)胞抑制率=(1－A實(shí)驗(yàn)孔/A空白對(duì)照孔)×100%進(jìn)行計(jì)算。

圖1 異咯嗪光敏劑的結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果

MTT法研究了異咯嗪光動(dòng)力對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制率影響。圖2顯示異咯嗪光動(dòng)力能明顯抑制Bel-7402細(xì)胞，在光照60 min后，異咯嗪表現(xiàn)出對(duì)Bel-7402細(xì)胞極強(qiáng)的殺傷能力，其抑制率達(dá)到70%左右。此外，MTT染色顯示：未經(jīng)異咯嗪光動(dòng)力處理的Bel-7402細(xì)胞MTT染色后，在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞周?chē)煞植急容^均勻的紫藍(lán)色Formazan結(jié)晶（圖3A）；而B(niǎo)el-7402細(xì)胞經(jīng)過(guò)經(jīng)異咯嗪光動(dòng)力作用后，細(xì)胞數(shù)目明顯降低，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞失去了還原MTT能力，導(dǎo)致紫藍(lán)色結(jié)晶明顯減少，細(xì)胞處于調(diào)亡和壞死狀態(tài)（圖3B）。

圖2 MTT法分析異咯嗪光動(dòng)力對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制率

圖3 MTT染色分析異咯嗪光動(dòng)力對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制作用

3 討論

一些研究顯示異咯嗪光動(dòng)力對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[7-8]，然而異咯嗪光動(dòng)力對(duì)Bel-7402細(xì)胞的抑制作用還鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，在該研究通過(guò)MTT染色法研究了異咯嗪光動(dòng)力對(duì)Bel-7402細(xì)胞作用。結(jié)果顯示，異咯嗪光動(dòng)力能明顯抑制Bel-7402細(xì)胞增殖。作用機(jī)理可能是：腫瘤細(xì)胞攝入的異咯嗪（A）在特定波長(zhǎng)激發(fā)后，通過(guò)系間竄躍，基態(tài)的A變?yōu)榧ぐl(fā)三線(xiàn)態(tài)（3A*）；3A*與H2O和O2反應(yīng)，或與三線(xiàn)態(tài)氧（3O2）反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）、超氧負(fù)離子自由基（·O-2）、單線(xiàn)態(tài)氧（1O2）等活性氧（reactive oxygen species,ROS）；ROS與細(xì)胞膜內(nèi)外的生物大分子(如蛋白質(zhì)、酶類(lèi)和脂類(lèi)等)發(fā)生氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致Bel-7402細(xì)胞凋亡或壞死。該過(guò)程可用如下反應(yīng)式表示：

[1]Lu K,He C,Lin W.Nanoscale metal-organic framework for highly effective photodynamic therapy of resistant head and neck cancer[J].J Am Chem Soc,2014,136(48):16712-16715.

[2]Li X,Zhou ZP,Hu L,et al.Apoptotic cell death induced by 5-aminolaevulinic acid-mediated photodynamic therapy of hypertrophic scar-derived fibroblasts[J].J Dermatolog Treat, 2014,25(5):428-433.

[3]Akens MK,Wise-Milestone L,Won E,et al.In vitro and in vivo effects of photodynamic therapy on metastatic breast cancer cells pre-treated with zoledronic acid[J].Photodiagnosis and photodynamic therapy,2014,11(3):426-433.

[4]Park K.J.,Lee C.H.,Kim A,et al.S.Death Receptors 4 and 5 Activate Nox1 NADPH Oxidase through Riboflavin Kinase to Induce Reactive Oxygen Species-mediated Apoptotic Cell Death[J].The Journal of Biological Chemistry,2012,287(5): 3313-3325,.

[5]Makdoumi K,B ckman A,Mortensen J,et al.Comparison of UVA-and UVA/riboflavin-induced growth inhibition of A-canthamoeba castellanii[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2013,251(2):509-514.

[6]Makdoumi K,B ckman A,Mortensen J,et al.Evaluation of antibacterial efficacy of photo-activated riboflavin using ultraviolet light(UVA)[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2010,248(2):207-212.

[7]Machado D,Shishido S.M,Queiroz K.C,et al.Irradiated riboflavin diminishes the aggressiveness of melanoma in vitro and in vivo[J].PLoS One,2013,8(1):E54269.

[8]De Souza Queiroz K.C.,Zambuzzi W.F.,Santos de Souza A. C,et al.A possible anti-proliferative and anti-metastaic effect of irradiated riboflavin in solid tumors[J].Cancer Letters, 2007，258(1):126-134.

Inhibition Effect of MTT Method in Detecting the Isoalloxazine Photodynamic on the Bel-7402 Cells

XIA Chun-hui,WANG Yu,CHEN Yu-hang,SUN Dong-sheng,FU Shuang,LI Hong-mei
Pharmacy College,Qiqihar Medical University,Qiqihar,Heilongjiang Province,161006 China

ObjectiveTo research the inhibition effect of MTT method in detecting the isoalloxazine photodynamic on the Bel-7402 cells.MethodsThe inhibition effect of isoalloxazine photodynamic on the Bel-7402 cells was measured by the MTT method.ResultsThe isoalloxazine photodynamic can obviously inhibit the Bel-7402 cells.ConclusionIsoalloxazine is a potential photosensitizer.

Isoalloxazine;Photodynamic;Apoptosis;Bel-7402 cells

R735.7

A

1672-5654（2017）01（c）-0047-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.03.047

2016-10-23）

齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（SFGG-201206）。

夏春輝（1969.12-），男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士，教授，研究方向：功能材料制備與抗腫瘤機(jī)制研究。