曲 巍

(北京靖雪萱健康科技有限公司，北京 100176)

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益生菌的篩選及安全性研究進(jìn)展

曲 巍

(北京靖雪萱健康科技有限公司，北京 100176)

益生菌作為有益菌，是身體中必不可少的要素之一，與諸多微生物一樣，對(duì)人類健康有著諸多益處，可促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。在益生菌的科學(xué)研究中，其生產(chǎn)、分離等都有著重要的應(yīng)用價(jià)值，在益生菌的培養(yǎng)周期內(nèi)，高溫狀態(tài)更能體現(xiàn)其活躍性。著重對(duì)益生菌的篩選分離進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)其安全性研究發(fā)展提出見(jiàn)解，以供參考。

益生菌；分離；篩選；安全性；發(fā)展

益生菌作為互利共生的微生物，在宿主體內(nèi)可保障宿主的健康，保障機(jī)體有序運(yùn)行。不同種類的益生菌有著不同的功效和作用，在醫(yī)學(xué)和食品研究中都有著極其重要的作用，尤其是在保健食品中，對(duì)人體健康有著諸多好處。

1 益生菌篩選的具體方法

1.1 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基；MRS固體培養(yǎng)基；產(chǎn)黏性培養(yǎng)基；葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基；抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)基；V-P反應(yīng)培養(yǎng)基；溶鈣圈檢測(cè)培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱；數(shù)顯恒溫水浴鍋；可見(jiàn)分光光度計(jì)；光學(xué)顯微鏡；pH計(jì)。

1.3 篩選方法

分離純化：將樣品10倍梯度稀釋，涂MRS平板，用石蠟封口，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，并分離純化。將菌株用甘油管法-20 ℃保藏。溶鈣圈實(shí)驗(yàn)：在溶鈣圈檢測(cè)培養(yǎng)基上，點(diǎn)種分離，37 ℃培養(yǎng)72 h，以此初步判斷菌株是否產(chǎn)酸。產(chǎn)氣性實(shí)驗(yàn)：將分離的菌株接種到帶有倒置杜氏小管的葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察杜氏小管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，同時(shí)還可以通過(guò)觀察培養(yǎng)液的顏色變化，確定菌株是否產(chǎn)酸，以此進(jìn)一步判斷是否產(chǎn)酸的標(biāo)準(zhǔn)。黏性實(shí)驗(yàn)：用MRS固體培養(yǎng)基，其中蔗糖代替葡萄糖。接種后于37 ℃培養(yǎng)24 h，用接種針挑取菌落直接觀察。抑菌實(shí)驗(yàn)：在不加乙酸鈉的MRS固體平板培養(yǎng)基上利用混菌法，接種新培養(yǎng)的指示菌(大腸桿菌和葡萄球菌)后，點(diǎn)種分離，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株的抑菌圈。

2 篩選結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果與分析

從樣品中共分離的21株菌(分別編號(hào)為1～21，其中1～10來(lái)源于樣品1，11～21來(lái)源于樣品2)。在分離純化過(guò)程中，對(duì)單菌落進(jìn)行了革蘭氏染色、鏡檢。其中編號(hào)1～3、6、7、9～11、17～21的13株菌能夠形成鈣溶解圈(以下稱“考查菌株”)。

從篩選分離實(shí)驗(yàn)中可以看出，革蘭氏陰性和陽(yáng)性的菌株都有溶鈣圈形成，在48 h內(nèi)都表現(xiàn)出溶鈣圈，且部分菌株在72 h內(nèi)形成明顯溶鈣圈。所有考查菌株都能形成抑菌圈，且都不產(chǎn)黏性物質(zhì)。

在產(chǎn)氣性實(shí)驗(yàn)中，編號(hào)1、2、6、7、9、20、21的7株菌沒(méi)有產(chǎn)生氣泡，3、10、11、17、18、19的6株菌有氣泡產(chǎn)生，且向其培養(yǎng)液中加入過(guò)量NaOH，輕搖試管，靜置一段時(shí)間，氣泡都不消失，證明所產(chǎn)氣體不是CO2，并觀察培養(yǎng)液顏色發(fā)生變化，只有17號(hào)菌株，培養(yǎng)液顏色沒(méi)有變化，無(wú)色，證明其不產(chǎn)酸。因此，確定編號(hào)1、2、3、6、7、9、10、11、18、19、20、21的12株菌為產(chǎn)酸益生菌。

2.2 菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力鑒定

將考查菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，以MRS液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每4 h用722分光光度計(jì)于650 nm測(cè)定菌液的OD值，用酸度計(jì)測(cè)定pH值。

通過(guò)數(shù)據(jù)可以看出：第一，所有菌株在培養(yǎng)8～12 h時(shí)，OD值達(dá)到最大，編號(hào)6、7、10、11、19、20的6株菌生長(zhǎng)迅速，1號(hào)菌株生長(zhǎng)最慢，在12～20 h時(shí)達(dá)到最大值。第二，pH值數(shù)據(jù)顯示，除1號(hào)菌株外都能降低1～2個(gè)點(diǎn)；6、11、19、20、21的5菌株變化最快，4 h后能降低2個(gè)點(diǎn)，在培養(yǎng)初期pH值不斷下降，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種下降趨勢(shì)逐漸變緩，所有菌株在20 h以后趨于平緩。

2.3 溫度對(duì)菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力的影響

用MRS液體培養(yǎng)基，在27 ℃～28 ℃培養(yǎng)24 h，以空白MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，用722分光光度計(jì)于650 nm測(cè)定菌液的OD值，用酸度計(jì)測(cè)定pH值。編號(hào)2、3、9、10、20、21的6株菌在高溫條件下生長(zhǎng)較好，低溫條件下明顯受到抑制。1號(hào)菌株表現(xiàn)出更適合低溫條件生長(zhǎng)，其菌體濃度高于高溫條件下培養(yǎng)的，pH值顯示在低溫條件下酸度更大。編號(hào)6、7、11、18、19的5株菌的OD值和pH值受溫度變化影響不明顯。

3 益生菌的安全性研究進(jìn)展

3.1 益生菌的安全性研究進(jìn)展

常用的安全性研究檢驗(yàn)方法主要有兩種：第一，厭氧研究檢驗(yàn)法。微生物大多在厭氧環(huán)境下易于生存繁衍，因此，應(yīng)用厭氧狀態(tài)對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)。微生物在厭氧狀態(tài)下繁衍速度加快，而需氧的微生物在無(wú)氧狀態(tài)下會(huì)死亡，這樣在無(wú)氧狀態(tài)下檢驗(yàn)就會(huì)使益生菌含量提高。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要注意掌握時(shí)間，如果檢驗(yàn)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，檢驗(yàn)結(jié)果就會(huì)不準(zhǔn)確。第二，體內(nèi)研究檢驗(yàn)法。此種檢驗(yàn)法主要是在益生菌本體的體外利用培養(yǎng)器皿進(jìn)行益生菌的安全性檢驗(yàn)。這項(xiàng)安全性檢測(cè)技術(shù)在我國(guó)的益生菌繁衍中還不夠成熟，通常都是用小白鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)數(shù)周的連續(xù)觀察就能得到相關(guān)結(jié)論。

3.2 益生菌的安全性檢驗(yàn)方法

作為人體生命活動(dòng)和身體肌能的應(yīng)用基礎(chǔ)和主體，益生菌對(duì)人類健康具有重要的影響，也是維持人體生命體征穩(wěn)定運(yùn)行的有效保證，主要有兩種安全性檢驗(yàn)方法：第一，重量之差檢驗(yàn)方法。益生菌是保健食品中必不可少的物質(zhì)，在人體中發(fā)揮著重要的作用，直接關(guān)系著人體肌能和生命健康。在重量之差檢驗(yàn)中，要先烘干，冷卻稱重，記錄第一次的稱重重量，在器皿中倒出上一層的液體，然后對(duì)下層液體進(jìn)行烘干，烘干之后冷卻，置于器皿中稱重。兩次稱重后，將稱重結(jié)果進(jìn)行做差比較。這種檢驗(yàn)方法檢測(cè)準(zhǔn)確性較高，但過(guò)程較復(fù)雜，容易出現(xiàn)失誤。第二，比濁檢驗(yàn)法。比濁檢驗(yàn)法是益生菌檢驗(yàn)中應(yīng)用比較廣泛的一種，檢測(cè)準(zhǔn)確度較高，可節(jié)省時(shí)間和精力。在檢測(cè)過(guò)程中，檢驗(yàn)樣品需要稀釋大約數(shù)十倍，取出樣品后，在接近人體體溫的溫度下，用厭氧環(huán)境進(jìn)行益生菌培育，大約16 h左右，就可以用600 nm的光罩檢測(cè)吸取光值，在兩次光值吸取后做差計(jì)算，這種方法檢測(cè)的益生菌濃度準(zhǔn)確率較高。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)益生菌的篩選試驗(yàn)，最終得出12株產(chǎn)酸菌，多數(shù)菌在培養(yǎng)初期，pH值不斷下降，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，下降趨勢(shì)變緩。按理論分析，菌產(chǎn)生有機(jī)酸的強(qiáng)度應(yīng)與時(shí)間成正比，但實(shí)驗(yàn)中卻發(fā)現(xiàn)有時(shí)成反比，這可能與細(xì)胞自溶、儀器老舊等因素有關(guān)。實(shí)驗(yàn)獲得了6株菌在高溫條件下產(chǎn)酸能力強(qiáng)、1株菌在低溫條件產(chǎn)酸能力強(qiáng)，這些優(yōu)勢(shì)菌株將會(huì)繼續(xù)篩選。選出生長(zhǎng)更好、產(chǎn)酸能力更強(qiáng)的菌株后，如何利用它們，還需要深入研究和探索。

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Research advances in screening and safety of probiotics

QU Wei

(Beijing Jingxuexuan Health Technology Co., Ltd., Beijing 100176, China)

As beneficial bacteria, probiotics is one of the essential elements in body, which can promote the absorption of nutrients. Production and separation of probiotics are found have important application value. In culture cycle of probiotic, its activity can be reflected under the high temperature state. The selection and separation of probiotics were researched, and opinions on its safety research was proposed for reference.

Probiotics; Isolation; Screening; Safety; Development

2016-10-29

曲巍(1982-)，女，碩士研究生，食品工程師。

TS201.3

A

1674-8646(2017)02-0080-02