于 佳，王海菲，楊夢(mèng)怡，劉心蕊，李 雪，潘朋歌

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)系，寧夏 銀川 750004；2.寧夏生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004）

女性配子發(fā)源地為卵巢，伴隨著周期性卵泡的發(fā)育，雌、孕激素也進(jìn)行周期性的分泌，成為女性健康的保護(hù)神。然而過(guò)去幾十年里，隨著腫瘤治療和診斷水平不斷得到提高，癌癥女孩和青年女性的生存率也得到明顯提高，但其中的化療及放療方法卻對(duì)她們的生育能力起到了危害的作用。從而喪失卵泡功能，導(dǎo)致女性失去了生育能力，同時(shí)女性體內(nèi)的雌激素水平顯著降低，降低絕經(jīng)后女性的生活質(zhì)量。故此，在正式進(jìn)行抗癌治療過(guò)程中，需針對(duì)患者卵巢進(jìn)行凍存處理，待患者病癥得到有效控制后，再將其移植到患者體內(nèi)，進(jìn)而達(dá)到保障患者生育功能的目的。本研究室前期研究顯示，在促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）的干預(yù)下，可有效保障在玻璃化凍融卵巢條件下，卵泡的成活情況[1-2]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

性成熟健康C57 BL/6J♀100只，體重25～30 g；♂60只，體重30～35 g，購(gòu)自美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室（證號(hào)：000664）。所有小鼠均自由進(jìn)行攝食，且室內(nèi)溫度控制在20度左右，對(duì)應(yīng)濕度控制在50%左右，并保障室內(nèi)通風(fēng)情況。

1.2 主要試劑與儀器

本次研究主要涉及為注射用重組人促卵泡刺激素以及濃度在90%以上的人血清白蛋白，研究過(guò)程中所使用熒光生物顯微鏡，由日本生產(chǎn)，型號(hào)為OLYMPUS，常規(guī)倒置熒光顯微鏡，型號(hào)為，CK40，Leica DME實(shí)體顯微鏡，液氮罐（美國(guó)MVE）。

1.3 試驗(yàn)方法

取非干預(yù)玻璃化凍存組（vitrification test group,VTG）簡(jiǎn)稱新鮮移植組和玻璃化凍存FSH干預(yù)組（FSH-VG）簡(jiǎn)稱玻璃化凍存組的出生子代進(jìn)行試驗(yàn)。所有小鼠在出生后12小時(shí)，即斷奶。隨后結(jié)合小鼠生長(zhǎng)情況，針對(duì)其生理發(fā)育、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況等展開(kāi)統(tǒng)計(jì)。

1.4 行為測(cè)試方法

按文獻(xiàn)[3-4]介紹的程序進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠出生時(shí)一般情況

觀察可知，所有新生小鼠皮膚均表現(xiàn)為紅色，且不存在有毛發(fā)，雙眼沒(méi)有睜開(kāi)，雙耳粘貼在皮膚上。兩組進(jìn)行比較均沒(méi)有出現(xiàn)明顯外觀畸形。

2.2 兩組仔鼠體重變化情況

結(jié)合對(duì)小鼠體重變化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可知，在出生后2周時(shí)間后，小鼠體重增加速度明顯加快。且組間對(duì)比可知，體重變化情況不存在有顯著差異P＞0.05。

2.3 兩組小鼠生理發(fā)育指標(biāo)測(cè)試結(jié)果

結(jié)合統(tǒng)計(jì)可以發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠各方面生理指標(biāo)均逐漸達(dá)標(biāo)，且在達(dá)標(biāo)時(shí)間上未存在有明顯差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

2.4 兩組小鼠神經(jīng)反射和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力結(jié)果

比較后發(fā)現(xiàn)：兩組小鼠神經(jīng)反射和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力指標(biāo)達(dá)標(biāo)日期大致相當(dāng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

3 討 論

近20年來(lái)，醫(yī)院采用新型化療及放療方案，有效提高惡性腫瘤的年輕女性及兒童的存活率，但對(duì)于細(xì)胞分裂活動(dòng)較為頻繁的卵巢組織來(lái)說(shuō)，應(yīng)用大劑量的化療和放療會(huì)造成無(wú)法修復(fù)的損傷，使得女性患者卵巢出現(xiàn)早衰的現(xiàn)象，嚴(yán)重情況下甚至喪失生殖能力。而有研究表明對(duì)于女性大量卵泡，卵巢的玻璃化冷凍技術(shù)可以做到一次性地保存，待卵巢組織得到有效恢復(fù)后，再借由體外培養(yǎng)等方式，進(jìn)而達(dá)到輔助生育的效果。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SH進(jìn)行干預(yù)的玻璃化凍存組和新鮮移植組相比不具有明顯差別，提示FSH可以作為干預(yù)因素的添加，對(duì)于玻璃化冷凍過(guò)程起到有利，并且不會(huì)對(duì)出生后子代小鼠的生理發(fā)育、成熟情況和神經(jīng)發(fā)育造成影響，沒(méi)有出現(xiàn)延遲發(fā)育。然而，凍融卵巢的遺傳安全性除了與新生子代生理發(fā)育的一般情況密切相關(guān)，還與子代的表觀遺傳修飾異常以及對(duì)子代的長(zhǎng)期觀察具有一定的關(guān)聯(lián)性。因此，我們今后的研究方向應(yīng)該以凍融卵巢移植子代表現(xiàn)遺傳信息的改變?yōu)橹鳌?/p>

[1] 吳 昊,蔡玉芳,張 紅,等.FSH干預(yù)對(duì)小鼠玻璃化凍融移植卵巢血流重建的影響.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)[J],2014,36(5)∶478-505.

[2] 張 紅,馬文葉,楊延周,等.小鼠卵巢玻璃化凍融過(guò)程中FSH干預(yù)對(duì)VEGF及αvβ3表達(dá)的影響.生殖與避孕[J],2015,35(4)∶230-236.