任艷青 李葆林 田宇柔 牛麗穎 甄亞欽 王鑫國(guó)(石家莊 050091)

河北中醫(yī)學(xué)院 河北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心

梔子、連翹等中藥配方顆粒體外肝細(xì)胞毒性研究*

任艷青 李葆林 田宇柔 牛麗穎 甄亞欽 王鑫國(guó)(石家莊 050091)

河北中醫(yī)學(xué)院 河北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心

目的：對(duì)梔子、連翹、大黃、續(xù)斷、首烏藤、麻黃、淫羊藿、丹參、地黃、陳皮10種中藥配方顆粒的體外肝細(xì)胞毒性進(jìn)行研究評(píng)價(jià)。方法：以人正常肝細(xì)胞LO2為研究對(duì)象，設(shè)定一系列濃度梯度，MTT法觀察不同濃度配方顆粒對(duì)LO2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用；Hoechst33258熒光染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)。結(jié)果：100、1 000mg/L梔子配方顆粒對(duì)LO2細(xì)胞呈現(xiàn)明顯毒性作用(P<0.05或P<0.01)，熒光染色可見(jiàn)明顯的核熒光強(qiáng)度增強(qiáng)、固縮等凋亡表現(xiàn)；連翹等其他9種配方顆粒在0.001～1 000mg/L范圍內(nèi)，對(duì)LO2細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用(P>0.05)，也未觀察到明顯的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變。結(jié)論：本研究以中藥配方顆粒作為體外實(shí)驗(yàn)的載體，對(duì)梔子、連翹等10種常用中藥配方顆粒的早期肝毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，提示梔子配方顆粒若在較大劑量下使用，可能會(huì)存在明顯的肝臟毒性，其他9種中藥配方顆粒對(duì)人正常肝細(xì)胞LO2無(wú)明顯毒性，為上述中藥配方顆粒的臨床應(yīng)用提供了參考。

中藥配方顆粒；梔子；連翹；大黃；續(xù)斷；首烏藤；麻黃；肝細(xì)胞毒性；安全性評(píng)價(jià)；LO2細(xì)胞

中藥配方顆粒是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，采用現(xiàn)代科技手段將傳統(tǒng)中藥飲片按一定的生產(chǎn)工藝制成的提取物與適當(dāng)?shù)妮o料或藥材細(xì)粉制成的供臨床調(diào)劑使用的粉狀或顆粒狀產(chǎn)品。[1]目前關(guān)于中藥配方顆粒的研究多集中在化學(xué)成分分析、臨床應(yīng)用、工藝和藥效學(xué)等方面，研究最少的是毒性和臨床安全性，[2]對(duì)中藥配方顆粒的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)是配方顆粒研究中亟待解決的問(wèn)題，中藥配方顆粒體外肝細(xì)胞毒性相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究以中藥配方顆粒為載體，利用MTT、熒光染色技術(shù)，觀察了梔子、連翹、大黃、首烏藤、續(xù)斷、麻黃、淫羊藿、丹參、地黃、陳皮10種常用中藥配方顆粒對(duì)體外培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞毒性的影響，為上述藥物的臨床安全應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 梔子10g飲片/g配方顆粒，梔子苷含量126.9mg/g(每1g配方顆粒相當(dāng)于臨床10g中藥飲片使用量，經(jīng)高效液相檢測(cè)，每1g配方顆粒中梔子苷含量為126.9mg)，產(chǎn)品批號(hào)14081811；連翹14.3g飲片/g配方顆粒，連翹苷含量15.5mg/g，產(chǎn)品批號(hào)14090711；大黃2.4g飲片/g配方顆粒，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量之和為8.9mg/g，產(chǎn)品批號(hào)14121811；續(xù)斷9.1g飲片/g配方顆粒，川續(xù)斷皂苷VI含量67.1mg/g，產(chǎn)品批號(hào)15010411；首烏藤18.8g飲片/g配方顆粒，1,2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量40.3mg/g，產(chǎn)品批號(hào)15012811；麻黃10g飲片/g配方顆粒，鹽酸麻黃堿含量24.9mg/g，產(chǎn)品批號(hào)14082811；淫羊藿20g飲片/g配方顆粒，淫羊藿苷含量42.9mg/g，產(chǎn)品批號(hào)14100921；丹參5.6g飲片/g配方顆粒，丹酚酸B含量24.5mg/g，產(chǎn)品批號(hào)14081411；地黃5g飲片/g配方顆粒，梓醇含量18.8mg/g，產(chǎn)品批號(hào)14060911；陳皮6g飲片/g配方顆粒，橙皮苷含量6.7mg/g，產(chǎn)品批號(hào)14122121，以上配方顆粒均由石家莊神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。

1.2 細(xì)胞 人正常肝細(xì)胞株LO2，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

1.3 試劑 高糖DMEM、胎牛血清(均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(均購(gòu)自美國(guó)Amresco公司)；Hoechst33258(美國(guó)ThermoFisherScientific公司)。

1.4 儀器MCO-15ACCO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)；超凈工作臺(tái)(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；DMI3000B倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica)；MultiskanFC酶標(biāo)儀(美國(guó)ThermoFisherScientific公司)。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)：快速將凍存的LO2細(xì)胞置于 37 ℃水浴復(fù)蘇，復(fù)蘇后800r/min離心5min，吸去上清加入5mL含 15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%匯合時(shí)即可進(jìn)行傳代：棄舊培養(yǎng)基，1×PBS清洗細(xì)胞3次，0.25%胰酶消化，輕輕吹打細(xì)胞，待細(xì)胞分散后加入完全高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，1︰3傳代，細(xì)胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.2 藥物配制：將連翹、大黃等10種中藥配方顆粒直接溶解于無(wú)血清高糖DMEM中，溶解性均良好，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，依次稀釋至工作濃度1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001mg/L。

1.5.3 細(xì)胞毒性檢測(cè)：生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LO2細(xì)胞消化后制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種到96孔板，每孔100μL，細(xì)胞培養(yǎng)24h后換用無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h使細(xì)胞饑餓，分裂活動(dòng)停止，吸棄無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔加入相應(yīng)的藥物孵育24h，藥物作用時(shí)間結(jié)束后吸棄含有藥物的培養(yǎng)基，每孔加入新鮮無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)基100μL、MTT20μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸除上清，每孔加入100μLDMSO將結(jié)晶溶解，微量振蕩儀振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)分析儀檢測(cè)各孔于492nm處的OD值。

1.5.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)染色觀察：參照文獻(xiàn)[3]方法，LO2細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，同步化24h，每種配方顆粒選定1、1 000mg/L兩個(gè)作用濃度，孵育細(xì)胞24h后棄掉含藥培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10min，吸棄多聚甲醛，PBS再次漂洗3次，每孔加入終濃度為5μg/mL的Hoechst33258 染液100μL，室溫避光孵育10min，PBS輕輕漂洗2次，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照。

2 結(jié)果

2.1 梔子、連翹等10種中藥配方顆粒的LO2細(xì)胞毒作用 與空白對(duì)照組相比，0.01、0.1mg/L梔子配方顆粒可明顯促進(jìn)LO2細(xì)胞增殖(P<0.05或P<0.01)，但100、1 000mg/L梔子配方顆粒孵育細(xì)胞，OD值明顯下降，呈現(xiàn)出明顯的毒性作用(P<0.05或P<0.01)；連翹、大黃、續(xù)斷、首烏藤、麻黃、淫羊藿、丹參、地黃、陳皮9種配方顆粒在0.001～1 000mg/L范圍內(nèi)對(duì)培養(yǎng)的LO2細(xì)胞均無(wú)明顯毒性作用(P>0.05)，1、10、100mg/L大黃配方顆粒、100、1 000mg/L續(xù)斷配方顆粒，1 000mg/L淫羊藿配方顆粒，10、100、1 000mg/L丹參配方顆粒孵育細(xì)胞，OD值顯著上升，體現(xiàn)出了明顯的促LO2細(xì)胞增殖作用(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

藥物OD值正常對(duì)照0.001mg/L0.01mg/L0.1mg/L1mg/L10mg/L100mg/L1000mg/L梔子0.42±0.0270.41±0.0280.49±0.056*0.51±0.032**0.46±0.0410.43±0.0550.34±0.048*0.20±0.028**連翹0.42±0.0480.51±0.0610.50±0.0610.45±0.0500.53±0.0480.47±0.0800.43±0.0700.44±0.092大黃0.37±0.0530.44±0.0250.42±0.0340.40±0.0340.49±0.052*0.50±0.075*0.48±0.030*0.42±0.056續(xù)斷0.43±0.0800.41±0.0560.47±0.0720.47±0.0860.51±0.1090.54±0.0680.57±0.075*0.58±0.052*首烏藤0.44±0.0480.45±0.0510.51±0.0810.47±0.0840.51±0.0720.46±0.0390.45±0.0600.46±0.056麻黃0.43±0.0630.49±0.0440.51±0.0730.50±0.0500.47±0.0510.42±0.0120.45±0.0490.47±0.078淫羊藿0.37±0.0240.42±0.0550.45±0.0840.45±0.0440.44±0.0470.46±0.0840.42±0.0530.49±0.067*丹參0.42±0.0500.43±0.0540.40±0.0390.43±0.0340.49±0.0700.51±0.058*0.54±0.053*0.57±0.061*地黃0.40±0.0260.45±0.0650.40±0.0200.44±0.0410.42±0.0350.43±0.0620.41±0.0270.39±0.028陳皮0.41±0.0370.38±0.0410.39±0.0180.40±0.0610.39±0.0330.37±0.0360.40±0.0350.36±0.034

注：與正常對(duì)照組比較，*P< 0.05,**P< 0.01

2.2 連翹、大黃等10種中藥配方顆粒對(duì)細(xì)胞核形態(tài)的影響 顯微鏡下觀察可見(jiàn)1 000mg/L梔子配方顆粒組細(xì)胞核濃染，并呈現(xiàn)出明顯的核固縮；其余各給藥組細(xì)胞與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，細(xì)胞核形態(tài)無(wú)明顯差異，均未觀察到明顯的凋亡特征，細(xì)胞呈均勻淡染的藍(lán)色熒光，核形態(tài)完好，詳見(jiàn)圖1。

圖1 10種配方顆粒Hoechst 33258染色觀察(×200)

3 討論

肝臟是藥物產(chǎn)生毒性的重要靶器官，隨著中藥臨床的廣泛應(yīng)用以及近年來(lái)中藥毒理學(xué)研究的不斷深入，中藥導(dǎo)致肝損傷的報(bào)道逐漸增多，越來(lái)越引起人們的重視，[4-5]中藥致肝毒性損傷已成為令人關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，[6]藥物的肝細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)在早期毒理學(xué)評(píng)價(jià)中起著至關(guān)重要的作用。[7]中藥配方顆粒是利用先進(jìn)的生產(chǎn)技術(shù)和現(xiàn)代分析測(cè)試方法對(duì)中醫(yī)傳統(tǒng)用藥方式所進(jìn)行的一次變革，是對(duì)傳統(tǒng)中藥飲片的繼承和創(chuàng)新，它將推動(dòng)我國(guó)中藥研究和生產(chǎn)的發(fā)展。建立中藥配方顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，解決中藥配方顆粒最基本的真?zhèn)舞b別、質(zhì)量?jī)?yōu)劣及安全性評(píng)價(jià)等問(wèn)題是中藥配方顆粒行業(yè)發(fā)展和國(guó)際化的當(dāng)務(wù)之急，[8-9]中藥配方顆粒安全性的研究目前尚缺乏系統(tǒng)的研究資料，中藥配方顆粒體外肝細(xì)胞毒性相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)中藥配方顆粒進(jìn)行早期肝細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，是中藥配方顆粒研究中急需解決的問(wèn)題。

近年來(lái)體外肝細(xì)胞在藥物的早期安全性評(píng)價(jià)中逐漸成為通用的肝毒性評(píng)價(jià)體外試驗(yàn)工具，并廣泛應(yīng)用于藥物細(xì)胞毒性的早期研究。[7]藥物對(duì)細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)可以從細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖活性、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝功能和細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能等多個(gè)方面進(jìn)行，[10-11]人正常肝細(xì)胞LO2目前已成為研究藥物肝毒性的重要細(xì)胞模型，[12]細(xì)胞水平的毒性篩選可快捷迅速的發(fā)現(xiàn)有潛在毒性的藥物，所以在中藥配方顆粒肝細(xì)胞毒性研究中，筆者采用體外實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行篩選，以MTT、細(xì)胞核熒光染色為手段，為藥物安全性評(píng)價(jià)提供先期的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在MTT篩選中，為充分暴露其毒性反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中每種受試物的濃度涵蓋從較低的藥理學(xué)劑量到毒理學(xué)劑量，研究發(fā)現(xiàn)，連翹、大黃、續(xù)斷、首烏藤、麻黃、淫羊藿、丹參、地黃、陳皮9種常用中藥配方顆粒在0.001～1 000 mg/L范圍內(nèi)對(duì)培養(yǎng)的LO2細(xì)胞均無(wú)明顯毒性作用，熒光染色也未觀察到細(xì)胞核受損后所發(fā)生的核固縮等典型的凋亡形態(tài)特征。實(shí)驗(yàn)中筆者還發(fā)現(xiàn)，梔子配方顆粒0.01、0.1 mg/L，大黃配方顆粒1、10、100 mg/L，續(xù)斷配方顆粒100、1 000 mg/L，淫羊藿配方顆粒1 000 mg/L，丹參配方顆粒10、100、1 000 mg/L可促進(jìn)LO2細(xì)胞增殖，提示上述中藥配方顆?？赡軐?duì)肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，但還有待進(jìn)一步的研究，另外，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)100、1 000 mg/L梔子配方顆粒孵育細(xì)胞，細(xì)胞毒性作用明顯，熒光染色也觀察到了核熒光強(qiáng)度增強(qiáng)、固縮等凋亡的典型特征，提示梔子配方顆粒若在較大劑量下使用，可能會(huì)存在明顯的肝臟毒性，其導(dǎo)致肝毒性的直接物質(zhì)基礎(chǔ)及毒作用機(jī)制課題組目前正在進(jìn)行深入的研究。綜上所述，本研究從體外細(xì)胞水平，采用細(xì)胞毒理學(xué)方法，探討了多種配方顆粒的體外肝細(xì)胞毒性，本研究為中藥配方顆粒的安全性評(píng)價(jià)提供了參考資料，并可為臨床安全應(yīng)用提供參考。

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(2016-11-07 收稿)

*河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目：No.H2014206302；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目：No.ZD2015001；河北省中醫(yī)藥 管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目：No.2014007；河北中醫(yī)學(xué)院青年教師科研基金項(xiàng)目：No.QNZ2014007

王鑫國(guó)，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

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1007-5615(2017)01-0043-04