楊玉琪，徐修禮，馬越云，史皆然，周 珊，周 磊，郝曉柯

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032)

·論著·

重癥監(jiān)護(hù)病房分離金黃色葡萄球菌的分子流行特征

楊玉琪，徐修禮，馬越云，史皆然，周 珊，周 磊，郝曉柯

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032)

目的 了解某三甲醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者分離金黃色葡萄球菌的分子流行特點(diǎn)及其同源性，為有效控制醫(yī)院感染的發(fā)生提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。方法 收集該院2013年3—8月ICU患者各類感染標(biāo)本分離的62株金黃色葡萄球菌，采用PCR方法擴(kuò)增7個(gè)管家基因并進(jìn)行測(cè)序分析，采用多位點(diǎn)序列分型(MLST)技術(shù)獲得菌株ST分型，對(duì)ST分型進(jìn)行親緣關(guān)系分析。結(jié)果 62株金黃色葡萄球菌均可以擴(kuò)增出7個(gè)管家基因的特異性產(chǎn)物；共分為10個(gè)ST基因型，其中2個(gè)基因型為新發(fā)現(xiàn)的ST型(STn1和STn2)，1個(gè)為國(guó)內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的ST型(ST675)。ST239是ICU患者分離的金黃色葡萄球菌主要ST型別，占74.20%，分布于6個(gè)ICU，分布范圍最廣；其次為ST5，分布于3個(gè)ICU。62株菌株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成7個(gè)主要分支，檢出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)55株，占88.71%。結(jié)論 醫(yī)院ICU分離的金黃色葡萄球菌具有一定的同源性，并且少數(shù)型別表現(xiàn)出集中分布趨勢(shì)。

重癥監(jiān)護(hù)病房； 金黃色葡萄球菌； 多位點(diǎn)序列分型； 基因； 同源性

[Chin J Infect Control，2017，16(2)：99-103]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為革蘭染色陽(yáng)性球菌，是一種重要的病原菌，也是近年來(lái)引起醫(yī)院感染的主要病原菌之一[1]。金黃色葡萄球菌由于傳播途徑廣、致病性強(qiáng)、抵抗力較強(qiáng)，在醫(yī)院內(nèi)的傳播較為廣泛，已經(jīng)成為醫(yī)院感染預(yù)防和控制的棘手問題[2]。金黃色葡萄球菌尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococusaureus，MRSA)，已經(jīng)引起臨床醫(yī)務(wù)人員越來(lái)越多的重視，而且金黃色葡萄球菌醫(yī)院內(nèi)傳播也成為醫(yī)院感染控制的重點(diǎn)問題。因此，分析臨床分離的金黃色葡萄球菌分子流行病學(xué)特點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行基因同源性分析，有助于及時(shí)判斷醫(yī)院感染的傳染源，明確傳播途徑，對(duì)預(yù)防和控制醫(yī)院感染具有重要意義。本研究對(duì)重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)分離收集的62株金黃色葡萄球菌進(jìn)行菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)用多位點(diǎn)序列分型技術(shù)(MLST)進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，采用eBURST軟件分析其基因同源性，了解金黃色葡萄球菌在醫(yī)院ICU的傳播及流行狀況，為臨床合理使用抗菌藥物及有效控制醫(yī)院感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集某醫(yī)院2013年3—8月ICU住院患者各種感染標(biāo)本分離的62株金黃色葡萄球菌，并排除同一患者的重復(fù)菌株。

1.1.2 儀器與試劑 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀Phonenix 100(美國(guó)BD公司)，Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，溶葡萄球菌酶(BBI生命科學(xué)有限公司)，QIAamp DNA純化試劑盒(德國(guó)凱杰公司)， DU800核酸蛋白分析儀(美國(guó)Beckman公司)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)，DNA凝膠電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，凝膠電泳成像系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)，PCR反應(yīng)所用試劑(上海生工生物工程股份有限公司)，藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離、鑒定 采用常規(guī)培養(yǎng)分離方法，操作方法依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，應(yīng)用Phonenix 100 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀鑒定細(xì)菌。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用K-B法和頭孢西丁紙片法，按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2014年[3]規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)判定耐藥(R)、中介(I)、和敏感(S)。

1.2.3 細(xì)菌DNA的提取 使用QIAamp DNA純化試劑盒提取細(xì)菌DNA，首先對(duì)分離純化得到的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單菌落進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取，然后用Beckman DU800核酸蛋白分析儀檢測(cè)提取的DNA純度和濃度，確保提取的DNA質(zhì)量。

1.2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照金黃色葡萄球菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://saureus.mlst.net/)推薦的7個(gè)獨(dú)立的管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil)設(shè)計(jì)引物[4]，引物由上海生工生物工程股份有限公司提供，合成引物序列見表1。

表1 金黃色葡萄球菌MLST各管家基因引物序列及片段長(zhǎng)度

Table 1 Primer sequence and fragment length of housekeeping genes ofS.aureusMLST

管家基因引物(5’-3’)片段長(zhǎng)度(bp)arcCF:TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC456R:AGGTATCTGCTTCAATCAGCGaroEF:ATCGGAAATCCTATTTCACATTC456R:GGTGTTGTATTAATAACGATATCglpFF:CTAGGAACTGCAATCTTAATCC465R:TGGTAAAATCGCATGTCCAATTCgmkF:ATCGTTTTATCGGGACCATC429R:TCATTAACTACAACGTAATCGTAptaF:GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG474R:GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAAtpiF:TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA402R:TTTGCACCTTCTAACAATTGTACyqilF:CAGCATACAGGACACCTATTGGC516R:CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC

1.2.5 PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件 PCR反應(yīng)體系25 μL，其中Premix Taq 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板 2 μL，加無(wú)菌蒸餾水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.6 擴(kuò)增產(chǎn)物的驗(yàn)證、測(cè)序與比對(duì)分析 首先通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，然后將PCR產(chǎn)物送北京柏林羅核酸技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，并利用BioEdit軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正、拼接。

1.2.7 MLST型別 拼接后的結(jié)果與金黃色葡萄球菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，獲得對(duì)應(yīng)的7個(gè)管家基因的等位基因，然后根據(jù)7個(gè)等位基因型進(jìn)一步獲得該菌株的ST型別。

1.2.8 同源性分析 使用eBURST V3軟件(訪問地址：http://eburst.mlst.net)對(duì)62株金黃色葡萄球菌的ST基因型進(jìn)行親緣關(guān)系分析，借助BURST算法繪制類似于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的輻射狀圖。本實(shí)驗(yàn)參考菌株為中國(guó)臨床菌株，使用eBURST軟件按照嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)[4]繪制菌株ST親緣關(guān)系分布圖。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布 62株金黃色葡萄球菌分離自神經(jīng)外科ICU(26株)、神經(jīng)內(nèi)科ICU(16株)、消化科ICU(6株)、呼吸內(nèi)科ICU(6株)、麻醉科ICU(4株)、心臟外科ICU(2株)、燒傷科ICU(1株)和兒科ICU(1株)，其中痰標(biāo)本56株、咽拭子2株、分泌物、引流液、組織和糞便標(biāo)本各1株?；颊吣挲g0～94歲，平均48歲，男女性別比為1.95︰1(41/21)。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定結(jié)果 62株金黃色葡萄球菌均可以擴(kuò)增出7個(gè)管家基因的特異性產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為402 ～516 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。

圖1 金黃色葡萄球菌管家基因PCR擴(kuò)增電泳圖

Figure 1 PCR amplification electrophoresis map of house-keeping genes ofS.aureus

2.3 MLST分型結(jié)果 62株金黃色葡萄球菌共分為10個(gè)ST基因型，其中2個(gè)基因型為新發(fā)現(xiàn)的ST型(STn1和STn2)，1個(gè)為國(guó)內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的ST型(ST675)。ST239是金黃色葡萄球菌主要的ST型別，占74.20%，且分布于6個(gè)ICU，分布范圍最廣。其次為ST5，分布于3個(gè)ICU。ST630與ST239相比較，僅管家基因arcC的等位基因不同。ST675和STn2與ST5相比較，分別表現(xiàn)為管家基因aroE和glpF不同。62株金黃色葡萄球菌MLST分型結(jié)果及其在各科室的分布情況詳見表2。

表2 62株金黃色葡萄球菌科室分布及ST型別

Table 2 Department distribution and ST genotypes of 62S.aureusstrains

ST基因型等位基因譜(arcC-aroE-glpF-gmk-pta-tpi-yqil)科室分布株數(shù)構(gòu)成比(%)ST2392-3-1-1-4-4-3神經(jīng)外科ICU、神經(jīng)內(nèi)科ICU、燒傷科ICU、麻醉科ICU、呼吸內(nèi)科ICU、消化科ICU4674.20ST51-4-1-4-12-1-10神經(jīng)外科ICU、神經(jīng)內(nèi)科ICU、消化科ICU812.91ST204-9-1-8-1-10-8呼吸內(nèi)科ICU11.61ST5919-23-15-2-19-20-15兒科ICU11.61ST1883-1-1-8-1-1-1神經(jīng)內(nèi)科ICU11.61ST63012-3-1-1-4-4-3心臟外科ICU11.61ST6751-36-1-4-12-1-10神經(jīng)外科ICU11.61ST94418-18-6-59-13-15-18心臟外科ICU11.61STn11-4-1-23-12-240-10麻醉科ICU11.61STn21-4-327-4-12-1-10神經(jīng)內(nèi)科ICU11.61

2.4 藥敏結(jié)果 62株金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢西丁耐藥的MRSA共55株，占88.71%。所有菌株對(duì)11種常見抗菌藥物的藥敏結(jié)果見表3，只有敏感及耐藥菌株，無(wú)中介菌株。46株ST239型金黃色葡萄球菌均為MRSA，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性；而ST20型、ST188型、ST944型和STn1型金黃色葡萄球菌對(duì)11種常見抗菌藥物的敏感性相對(duì)較高。

表3 62株金黃色葡萄球菌對(duì)抗菌藥物的藥敏結(jié)果

Table 3 Antimicrobial susceptibility testing results of 62S.aureusstrains

抗菌藥物檢測(cè)株數(shù)耐藥株數(shù)耐藥率(%)敏感株數(shù)敏感率(%)頭孢唑林625588.71711.29頭孢西丁625588.71711.29阿米卡星444090.9149.09替考拉寧5900.0059100.00萬(wàn)古霉素6200.0062100.00利奈唑胺6100.0061100.00紅霉素625588.71711.29克林霉素624572.581727.42左氧氟沙星625385.48914.52呋喃妥因6200.0062100.00利福平443681.82818.18

2.5 eBURST分析結(jié)果 eBURST分析結(jié)果顯示，62株金黃色葡萄球菌10個(gè)ST型分布于中國(guó)臨床菌株分群的6個(gè)克隆群和1個(gè)散點(diǎn)(新型別STn1)。見圖2。在每個(gè)獨(dú)立的克隆群中，不同的ST型別用長(zhǎng)度不等的直線相連，直線的長(zhǎng)度表示不同ST型別之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。6個(gè)克隆群中，最大的克隆群為ST239克隆復(fù)合群，ST239為此克隆復(fù)合群中其他各ST型別共同的祖先(Founder)，ST630是ST239的一個(gè)亞群。第二大的克隆群為ST1克隆復(fù)合群，存在1個(gè)一級(jí)亞群(ST188)和1個(gè)二級(jí)亞群(ST2201)。在ST5克隆復(fù)合群中，本研究中的ST675、STn2均為中國(guó)臨床參考菌株中第一次出現(xiàn)的新的ST型別。新發(fā)現(xiàn)的STn1因?yàn)椴粚儆谌魏?個(gè)克隆復(fù)合群，在分析中以散點(diǎn)的形式分布。

*紅色數(shù)字代表本研究和數(shù)據(jù)庫(kù)均有的ST型；綠色數(shù)字代表僅在本研究中發(fā)現(xiàn)的ST型；黑色數(shù)字代表僅數(shù)據(jù)庫(kù)中有的ST型

3 討論

金黃色葡萄球菌是我國(guó)引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一，在該院也位居醫(yī)院感染分離病原菌的前三位[5]。近年來(lái)，金黃色葡萄球菌的耐藥率呈逐年升高趨勢(shì)[6]，尤其是MRSA在醫(yī)院感染中的比例大幅上升，導(dǎo)致臨床抗感染治療過程中可供選擇的藥物日益減少，使臨床抗感染治療變得更加棘手。研究[7]發(fā)現(xiàn)，2005年我國(guó)醫(yī)院MRSA的平均分離率在50%左右，而上海的醫(yī)院MRSA分離率可達(dá)78.4%。對(duì)金黃色葡萄球菌不同菌株間的親緣關(guān)系進(jìn)行分子生物學(xué)分析，可以幫助我們了解臨床分離的金黃色葡萄球菌的傳播特點(diǎn)和趨勢(shì)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)傳染源和尋找傳播途徑，為有效預(yù)防和控制金黃色葡萄球菌醫(yī)院感染暴發(fā)流行提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

本研究采用國(guó)際公認(rèn)的MLST方法，對(duì)醫(yī)院感染金黃色葡萄球菌進(jìn)行基因分型[8]，該方法通過直接擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的多個(gè)管家基因，并將管家基因測(cè)序分析與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從而確定菌株的基因型，獲得的基因型可與國(guó)內(nèi)外其他醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行數(shù)據(jù)共享。MLST分型結(jié)果顯示，62株金黃色葡萄球菌10個(gè)ST型共分布于6個(gè)克隆群和1個(gè)散點(diǎn)，其中ST239克隆復(fù)合群為流行優(yōu)勢(shì)菌群，占74.20%；其次為ST5克隆復(fù)合群，占總菌株的12.91%。該結(jié)果與Xiao等[9]的研究結(jié)果相符，該研究對(duì)中國(guó)大陸2011年27個(gè)省45個(gè)城市69家醫(yī)院分離的1 141株MRSA菌株進(jìn)行MLST分型，結(jié)果表明ST239克隆群為流行優(yōu)勢(shì)菌群(整體流行率為75.37%)，其次為ST5克隆群(整體流行率為12.62%)。Liu等[10]的研究報(bào)道，我國(guó)大部分地區(qū)MRSA流行株為ST239型菌株，說(shuō)明該院金黃色葡萄球菌MLST分型結(jié)果與全國(guó)大部分醫(yī)院的結(jié)果一致，以ST239克隆復(fù)合群和ST5克隆復(fù)合群為主，且菌株分布具有集中趨勢(shì)。

金黃色葡萄球菌ST型別與科室分布關(guān)系顯示，ST239為ICU患者感染的主要ST型別，分布于6個(gè)ICU，包括神經(jīng)外科ICU、神經(jīng)內(nèi)科ICU、燒傷ICU、呼吸內(nèi)科ICU、消化科ICU和麻醉科ICU，分布范圍最廣；而ST5的流行范圍僅次于ST239，分布于3個(gè)ICU，包括神經(jīng)外科ICU、神經(jīng)內(nèi)科ICU和消化科ICU。 62株金黃色葡萄球菌，主要分布于神經(jīng)外科ICU (26株，41.94%)和神經(jīng)內(nèi)科ICU(16株，25.81%)；菌株來(lái)源主要為痰標(biāo)本(56株，90.32%)，可能與大多數(shù)神經(jīng)外科ICU和神經(jīng)內(nèi)科ICU的住院患者本身疾病有關(guān)，患者通常無(wú)正常吞咽和咳嗽的能力，痰難以咳出，細(xì)菌容易在痰中滋生和繁殖，從而容易發(fā)生墜積性肺炎[11]；同時(shí)，一部分患者由于接受了吸痰、氣管插管和呼吸機(jī)輔助呼吸等具有侵入性的操作[12]，導(dǎo)致呼吸道的正常防御屏障遭到損害，從而導(dǎo)致肺部感染。

藥敏試驗(yàn)和MLST分型結(jié)果顯示，62株金黃色葡萄球菌中MRSA 55株(88.71%)，且MLST型別均屬于ST239克隆復(fù)合體和ST5克隆復(fù)合體；而ST20、ST188、ST944和STn1型別菌株的藥物敏感性卻表現(xiàn)為對(duì)11種抗菌藥物均敏感，由此推測(cè)菌株的藥物敏感性與其遺傳背景具有一定的相關(guān)性。對(duì)55株MRSA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有相似的耐藥譜，進(jìn)一步證明菌株間的遺傳背景與藥物敏感性相關(guān)。我們已將新發(fā)現(xiàn)的兩株ST基因型菌株信息及其雙向測(cè)序的峰圖文件提交至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，等待數(shù)據(jù)庫(kù)最終命名。

綜上所述，該院ICU感染的金黃色葡萄球菌以ST239基因型為主，且分布范圍較廣；菌株親緣關(guān)系分析結(jié)果顯示，62株金黃色葡萄球菌具有集中分布趨勢(shì)，以ST239和ST5克隆復(fù)合群為主，兩種克隆復(fù)合群具有相似的耐藥譜；說(shuō)明該院ICU金黃色葡萄球菌的感染存在醫(yī)院內(nèi)播散的趨勢(shì)，該結(jié)果與之前的研究結(jié)果[13]相符。因此，我們應(yīng)加強(qiáng)對(duì)臨床醫(yī)護(hù)人員的醫(yī)院感染預(yù)防控制的教育，嚴(yán)格按照醫(yī)療器械污染后導(dǎo)致感染的風(fēng)險(xiǎn)高低選擇相應(yīng)的滅菌或消毒方法，及時(shí)采取有效的預(yù)防和控制措施，防止醫(yī)院感染的暴發(fā)流行[14]。

本研究采用MLST方法進(jìn)行細(xì)菌分子流行病學(xué)方面的研究，該方法由于具有操作簡(jiǎn)單、用時(shí)較少且便于比較等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于微生物的分型研究[15-16]。但由于本實(shí)驗(yàn)收集菌株數(shù)量相對(duì)較少，研究時(shí)間跨度相對(duì)較短，所以本研究結(jié)果在不同科室內(nèi)是否存在主要ST型別尚未得出結(jié)論，需要完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，擴(kuò)大樣本量，開啟多中心、多地區(qū)相關(guān)流行病學(xué)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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(本文編輯：孟秀娟)

Molecular epidemiological characteristics ofStaphylococcusaureusisolated in intensive care units

YANGYu-qi,XUXiu-li,MAYue-yun,SHIJie-ran,ZHOUShan,ZHOULei,HAOXiao-ke

(XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Objective To investigate the molecular epidemiological characteristics and homology ofStaphylococcusaureus(S.aureus) isolated from patients in intensive care units (ICUs) of a hospital, so as to provide laboratory basis for the effective control of healthcare-associated infection(HAI). Methods 62S.aureusstrains isolated from various specimens from ICU patients with infection in March-August 2013 were collected, 7 housekeeping genes were amplified with polymerase chain reaction (PCR), the amplified products were sequenced, ST typing of strains was performed by multilocus sequence typing (MLST)， phylogenetic analysis of ST typing was conducted. Results 62S.aureusstrains were amplified specific product of 7 housekeeping genes; there were 10 ST genotypes, in which 2 ST genotypes(STn1and STn2) were first discovered，1 ST genotype(ST675) was first discovered domestically. ST239 was the main ST type ofS.aureusfrom ICU patients in this hospital, accounting for 74.20%，which distributed in 6 ICUs， ST5 distributed in 3 ICUs. 62 strains formed 7 main branches in the phylogenetic tree, 55 (88.71%) MRSA strains were detected. ConclusionS.aureusisolated from hospital ICUs has some homology, and the small number of types showed the trend of concentrated distribution.

intensive care unit；Staphylococcusaureus； multilocus sequence typing； gene; homology

2016-04-28

陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014JM4188)；國(guó)家儀器重大專項(xiàng)(2012YQ03026107)

楊玉琪(1987-)，女(漢族)，陜西省西安市人，技師，主要從事臨床微生物檢驗(yàn)及病原菌分子流行病學(xué)研究。

郝曉柯 E-mail: haoxkg@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.02.001

R181.3+2 R378.1+1

A

1671-9638(2017)02-0099-05