嚴芝光，周麗

（廣西壯族自治區(qū)防城港市第一人民醫(yī)院，廣西 防城港 538021）

綜述

結(jié)核桿菌實驗室檢測技術(shù)與臨床應(yīng)用進展

嚴芝光，周麗

（廣西壯族自治區(qū)防城港市第一人民醫(yī)院，廣西 防城港 538021）

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病。本文就結(jié)核桿菌實驗室檢測技術(shù)與其臨床實際應(yīng)用做如下綜述。

肺結(jié)核；結(jié)核分枝桿菌；檢驗技術(shù)；診斷

結(jié)核病是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，由結(jié)核分枝桿菌（MTB）感染而引起。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）統(tǒng)計我國是全世界22個結(jié)核病流行嚴重的國家之一[1]，患結(jié)核病人數(shù)居世界第2位。目前，結(jié)核病診斷手段歸納有以下3個方面：①實驗室診斷技術(shù)；②影像學(xué)診斷技術(shù)；③治療性診斷手段。結(jié)核分枝桿菌可以累及全身各個系統(tǒng)，造成了結(jié)核病的臨床表現(xiàn)多樣，尤其是肺外結(jié)核病變的診斷手段比較少，給臨床診斷帶來極大的困難，同時由于各種診斷方法的敏感性與特異性不高，導(dǎo)致結(jié)核病的控制更加復(fù)雜、困難。因此，在結(jié)核病實際防治工作當(dāng)中，如何提高疾病的早期診治成為控制結(jié)核病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著當(dāng)前醫(yī)療水平的提高，實驗室檢測技術(shù)在結(jié)核病診治方面體現(xiàn)出重要作用。為此，本文就結(jié)核桿菌實驗室檢測技術(shù)與其臨床實際應(yīng)用狀況進行如下綜述。

1 微生物學(xué)檢測技術(shù)及應(yīng)用

1.1 涂片染色技術(shù)

1.1.1 萋尼氏抗酸染色法（Z-N-AFS） Z-N-AFS具體操作是利用抗酸染液對痰涂片進行染色處理，讓后將其置于普通光學(xué)顯微鏡下進行鏡檢，每張Z-N染色痰涂片閱片時間約為5 min。此方法具有多種優(yōu)點，如操作簡便、價格低廉、檢測時間短、特異度高等，因此，是當(dāng)前廣泛用于結(jié)核病實驗室檢查的一項常用的診斷技術(shù)，同時是WHO推薦使用的結(jié)核病診斷技術(shù)之一。該方法的缺陷是敏感性較低，且存在不能有效區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的缺點。國外有文獻[2]報道Z-N-AFS敏感性僅占0%-44%；王震等[3]報道Z-N-AFS敏感性為35.29%；文獻[4,5]報道Z-N-AFS敏感性為13.85%-22.90%。

1.1.2 免疫磁珠捕獲抗酸染色法（IMC-AFS） 取捕獲處理后的免疫磁珠加小牛血清混勻后進行AFS制片，染色干燥后鏡檢。王震等[5]報道IMC-AFS敏感性為43.14%，比Z-NAFS敏感性提高，特異性相似；楊江華[6]報道IMC-AFS將有助于提高痰菌陰性結(jié)核病的診斷效率。該方法同樣具有檢驗時間短、操作較簡單、價格低、特異度高等優(yōu)點；缺陷與Z-N法相似。

1.1.3 熒光染色鏡檢法 其原理為：對抗酸桿菌進行熒光染色后，與菌體結(jié)合的染料可被特定波長的光線激發(fā)后產(chǎn)生熒光亮點，要求觀察50個視野，讀片時間為1 min-3 min。國外相關(guān)研究[7]指出，此方法在提高抗酸桿菌10%檢出率的同時能夠保持相似的特異度。隨著當(dāng)前科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，LED光源、熒光顯微鏡技術(shù)的發(fā)光二極管（LED）熒光顯微鏡應(yīng)運而生，在2011年，衛(wèi)生組織將其作為取代傳統(tǒng)熒光顯微鏡的技術(shù)，同時將其替代了以Z-N染色為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡檢測法。與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比，LED價格更低、使用壽命長，使用相對簡便。最近又發(fā)展了建立在熒光染色基礎(chǔ)上的全自動化讀片系統(tǒng)TBDx，通過將熒光染色后的涂片標本置于TBDx系統(tǒng)內(nèi)，便會自動讀取數(shù)據(jù)、報告檢驗結(jié)果；該系統(tǒng)每張涂片的讀片分析時間為5 min-6 min，其診斷準確率與專業(yè)人員判斷結(jié)果無顯著差異[8]。

1.2 結(jié)核菌培養(yǎng)技術(shù)

1.2.1 改良羅氏培養(yǎng)法（L-J） 目前，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)已被認證為結(jié)核分枝桿菌檢測、藥敏試驗的金標準。結(jié)核桿菌診斷的經(jīng)典方法是改良羅氏培養(yǎng)法。李寧等[9]報道的L-J法培養(yǎng)陽性率是7.1%，體現(xiàn)出此方法的多種應(yīng)用特點，如實驗費用低、有效保持細菌形態(tài)、可清晰地觀察菌落形成過程、便于對菌落施以菌型鑒定與耐藥性試驗等，然而由于耗時長（陰性報告需觀察8周）、敏感性不高等問題的存在，限制其實際應(yīng)用。

1.2.2 結(jié)核桿菌快速培養(yǎng)法 多數(shù)結(jié)核桿菌快速培養(yǎng)技術(shù)是由美國BD公司生產(chǎn)的Bactec MGIT960TB檢測系統(tǒng)，此系統(tǒng)是一款全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀，具備快速培養(yǎng)、檢測及藥敏技術(shù)，作用原理如下：采用分枝桿菌生長指示管法（MGIT），即在Middebrook7H9液體培養(yǎng)管中包埋有對氧濃度變化高度敏感的熒光顯示劑，以測定氧濃度變化為依據(jù)，對分支桿菌生長狀態(tài)進行檢測；一旦氧分子被消耗，便會出現(xiàn)培養(yǎng)基氧化還原電勢呈降低趨勢，而顯示劑則出現(xiàn)熒光，提示結(jié)果呈陽性。該技術(shù)敏感度高、檢測速度快，1周-3周即可檢測到分枝桿菌的生長。王馨[10]報道的陽性率為70.05%，Katila等[11]報道的陽性率為82.5%-94%。由此可知，此方法具有檢測時間短、檢出率高、特異性強等特點，但儀器、試劑昂貴，不易在基層診治單位推廣。

2 免疫血清學(xué)檢測技術(shù)及應(yīng)用

2.1 斑點免疫膠體金法（DIFA） 其作用原理如下：通過把分離純化的MTB特異性外膜蛋白/LAM點樣，加以固化在硝酸纖維膜載體上，對人血清內(nèi)MTB IgG抗體進行捕獲，并使用葡萄球菌A蛋白（SPA）膠體金綴合物進行標記，反應(yīng)時間15 min。王震等[3]報道該法特異性為70.00%，敏感性為60.78%；王志佳等[12]報道該法特異性為80.9%，敏感性為73.9%。DIFA法具有結(jié)果快速、可靠、操作簡單、不需進行鏡下觀察，適用于普通人群普查快速檢測和流行病學(xué)的調(diào)查。

2.2 免疫色譜法 免疫色譜法在臨床上應(yīng)用十分廣泛，該法與膠體金法的檢測方法基本一致，即非結(jié)核分枝桿菌不能分泌MPB64蛋白，但結(jié)核分枝桿菌可以有效分泌MPB64蛋白，進而達到鑒別區(qū)分目的[13]。衛(wèi)生組織提出，在臨床實際工作中可以通過結(jié)合免疫色譜法、液體培養(yǎng)鑒定分枝桿菌展開菌群，在成功分離培養(yǎng)結(jié)合分枝桿菌的同時也可以及時滿足藥敏試驗實際需求[14]。王軍喜[15]報道，對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進行免疫色普法檢測，經(jīng)統(tǒng)計分析可知靈敏度、特異度、陽性預(yù)期值、陰性預(yù)期值分別是98.5%、100.0%、100.0%、97.7%；免疫色譜法比膠體金法的臨床優(yōu)越性更為顯著，但是檢測成本比膠體金法本高。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 多采用間接法。原理為：經(jīng)結(jié)核桿菌純化蛋白衍生物（PPD）或細胞壁成分阿拉伯甘露聚糖脂（LAM）或重組的特異性蛋白質(zhì)抗原包被聚苯乙烯微孔板，與待檢血清及酶標抗人IgG抗體形成抗原抗體復(fù)合物，呈色反應(yīng)與抗結(jié)核桿菌抗體的水平成正比。國內(nèi)資料[16]報道該法敏感性為88.5%，特異性為97.3%。目前，ELISA法檢測已成為臨床用于檢測結(jié)核桿菌感染的重要免疫血清學(xué)檢測方法之一，在結(jié)核病診斷、應(yīng)用等方面得到普遍應(yīng)用。

2.4 干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫法 作用原理如下：通過將致病性結(jié)核分枝桿菌特有的RD1區(qū)編碼早期分泌靶向抗原6-kd（ESAT-6）、培養(yǎng)濾過蛋白10（CFP10）肽段庫作為抗原，對全血標本內(nèi)結(jié)核抗原特異性T細胞起到刺激作用，促進免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，干擾素的分泌，然后利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測結(jié)核特異性效應(yīng)T細胞，從而判斷待檢者是否感染結(jié)核分枝桿菌及感應(yīng)程度的方法。該方法以英國Oxford公司生產(chǎn)的T-SPOT.TB試劑盒及北京萬泰公司生產(chǎn)的TBIGRA試劑盒為代表。TB-IGRA和T-SPOT.TB檢測方法在靈敏度和特異度差異上無統(tǒng)計學(xué)意義[17]。其臨床應(yīng)用價值在于：①對肺內(nèi)、肺外結(jié)核患者具備較高的陽性率和特異性。鐘靖等[18]報道γ-干擾素釋放試驗對肺外結(jié)核的靈敏度為92.0%，特異性為94.0%；臨床局限性在于：①干擾素釋放試驗檢測費用相對較高，不適用經(jīng)濟不發(fā)達、貧困等地區(qū)的應(yīng)用；②干擾素釋放試驗難以對結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展等狀況作出良好的預(yù)測評估，加之臨床數(shù)據(jù)原因，就≤5個患者而言，難以提供更加精確的評價指標[19]。

3 分子生物學(xué)檢測技術(shù)及應(yīng)用

3.1 Xpert MTB/RIF技術(shù) Xpert MTB/RIF試驗是美國Cepheid公司研發(fā)的分子檢測技術(shù)，其以全自動半巢式實時PCR技術(shù)為基礎(chǔ)、以rpoB基因耐藥決定區(qū)為靶基因，能夠在2 h內(nèi)通過對分枝桿菌（MTB）、利福平（RIF）耐藥性進行檢測。新英格蘭雜志公布的研究結(jié)果表明以培養(yǎng)法為參考標準Xpert MTB/RIF的特異性為99.2%，敏感性為92.2%，2010年WHO首次推薦Xpert MTB/RIF技術(shù)的使用。由此可知，Xpert MTB/RIF技術(shù)在MTB、RIF耐藥性方面的特異性、敏感性均較高，充分體現(xiàn)出其操作簡便、監(jiān)測結(jié)果精準等特點，值得在結(jié)核病診療機構(gòu)中進行大力推廣、使用。

3.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù) 其原理如下：通過以人工合成的寡核苷酸片段為引物、以待擴增的DNA分子為模板，促使目的片段經(jīng)DNA聚合酶作用進行延伸，直至完成新DNA的合成。常用的有普通PCR技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)熒光探針技術(shù)和免疫磁珠捕獲聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（IMCPCR-ELIST）等。陸云鷗等報道[20]PCR熒光探針法的的陽性率與BD960液體培養(yǎng)法差異無統(tǒng)計學(xué)意義，僅需1 d就可以得到結(jié)果?？梢?，PCR技術(shù)的應(yīng)用效果理想，一方面可以保持檢測快速簡便，另一方面能夠提高檢測陽性率，便于結(jié)核病患者得到早期診治，尤其是抗酸染色陰性的活動性結(jié)核病患者。

3.3 重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)（RPA） RPA是一種新型的恒溫擴增技術(shù)，可以有效彌補PCR反應(yīng)過程精準熱循環(huán)的缺陷，即僅在恒溫環(huán)境下便可成功實現(xiàn)核酸分子擴增反應(yīng)，RPA反應(yīng)速度較快，一般從開始到完成只需5 min-15 min，而擴增產(chǎn)物可通過實時熒光、瓊脂糖電泳或金標記免疫反應(yīng)等方法檢測。體現(xiàn)出RPA技術(shù)操作簡便、快速靈敏度高等特點，適合于床旁快速檢測，有利于在基層單位或邊遠山區(qū)推廣。

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