李麗萍，屈晨雪，戴菊華，吳雪蓮

(北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034)

·綜述·

血小板糖基化的研究進(jìn)展

李麗萍，屈晨雪，戴菊華，吳雪蓮

(北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034)

糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要途徑之一。通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性，糖基化參與細(xì)胞功能的發(fā)揮及疾病的發(fā)生發(fā)展。血小板糖蛋白具有豐富的糖萼，其糖基化在血小板生成、分化中發(fā)揮重要作用，與出血及血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，多個(gè)糖蛋白分子，如P選擇素、C型凝集素樣受體2、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子等的糖基化修飾均參與調(diào)控血小板的功能。該文主要綜述了血小板糖基化在出血及血栓性疾病中的研究進(jìn)展及主要檢測(cè)方法。

血小板；糖蛋白；糖基化

糖基化是體內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。在酶的催化下糖鏈與肽鏈上的特定糖基化位點(diǎn)結(jié)合，或糖基之間生成糖苷鍵而發(fā)生共價(jià)結(jié)合,該過(guò)程稱為蛋白質(zhì)糖基化。糖基化在蛋白質(zhì)的折疊、相互作用、穩(wěn)定性、流動(dòng)性及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中均具有重要作用。糖蛋白糖鏈主要分為天冬酰胺連接的N-糖鏈和絲氨酸或蘇氨酸連接的O-糖鏈2大類。糖鏈主要有9種糖基，包括半乳糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、木糖、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、唾液酸，在高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)下依次延伸合成數(shù)百種不同的糖鏈結(jié)構(gòu)[1]。通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性，糖基化也參與維持細(xì)胞的正常功能以及疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[2]。研究證實(shí)，糖蛋白的糖基化水平或糖鏈結(jié)構(gòu)在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中均發(fā)生了改變，導(dǎo)致糖蛋白及其所在細(xì)胞的功能障礙，例如癌癥、炎癥反應(yīng)、自身免疫病等。目前超過(guò)50%的蛋白質(zhì)有糖基化，而現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中只有約10%注釋為糖蛋白。電子顯微鏡下顯示血小板表面含有豐富的糖蛋白，形成了豐富的糖萼，在其分化、發(fā)育及功能方面可能發(fā)揮重要作用。本綜述主要總結(jié)血小板糖基化的研究進(jìn)展及其主要檢測(cè)方法。

1 血小板糖基化與疾病

1.1血小板糖基化與出血性疾病 原發(fā)性免疫性血小板減少癥(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是一種免疫性血小板破壞過(guò)多造成的出血性疾病。目前公認(rèn)的血小板清除機(jī)制是Fc受體途徑介導(dǎo)的血小板破壞：抗血小板抗體與血小板膜糖蛋白結(jié)合，如糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(glycoprotein Ⅱb/Ⅲa,GPⅡb/Ⅲa)、糖蛋白Ⅰb(glycoproteinⅠb,GPⅠb)等，使血小板被單核-巨噬細(xì)胞吞噬。陶莉莉等[3]分析ITP患者血小板糖基化程度與一線治療療效相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)血小板糖基化水平可在一定程度上提示ITP患者治療效果，表明ITP患者血小板清除可能存在非Fcγ依賴途徑。提示血小板糖基化有助于詮釋部分難治性ITP的發(fā)病機(jī)制，為其治療提供新的思路。

3例遺傳性唾液酸缺陷患者臨床表現(xiàn)為出血，血小板減少，同時(shí)平均血小板體積增大[4]。其血小板GPⅠb表達(dá)水平正常，但十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳卻顯示GPⅠb移動(dòng)速率減慢，且與GPⅠb結(jié)合的花生凝集素含量減少，說(shuō)明唾液酸含量減低?？梢?jiàn)GPⅠb的唾液酸化水平在血小板的正常分化發(fā)育及功能發(fā)揮中產(chǎn)生一定的影響。

1.2血小板糖基化與血栓性疾病 先天性糖基化障礙(congenital disorder of glycosylation，CDG)疾病由于磷酸甘露糖酶(PMM2)發(fā)生突變，導(dǎo)致N-糖鏈糖基化異常。此類患者由于血小板自發(fā)聚集而導(dǎo)致血栓風(fēng)險(xiǎn)增加，而血小板糖蛋白潛在的低糖基化可能是導(dǎo)致血小板反應(yīng)亢進(jìn)的原因。而血小板N-糖鏈的糖蛋白(包括GPⅠbα)在數(shù)量和質(zhì)量上均沒(méi)有明顯變化，但血小板的半乳糖糖基化水平升高。提示血小板表面糖蛋白的異常糖基化修飾可能導(dǎo)致血小板自發(fā)性聚集造成血小板高反應(yīng)性[5]。

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂導(dǎo)致血栓形成是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)的病理生理基礎(chǔ)，血小板則參與血栓形成，在CHD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。CHD患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，血小板GPⅡb/Ⅲa和CD62P表達(dá)增高，呈現(xiàn)高反應(yīng)性，發(fā)生血栓風(fēng)險(xiǎn)增加[6]。周方元等[7]發(fā)現(xiàn)CHD患者中血清唾液酸水平明顯高于對(duì)照組，高水平的唾液酸可能通過(guò)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)白色血栓形成等方式加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。血小板膜表面GPⅠb是糖基化程度最高的唾液酸糖蛋白，其唾液酸含量占血小板膜表面糖含量的64%。同時(shí)，動(dòng)脈粥樣斑塊破裂暴露內(nèi)皮細(xì)胞后，血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ與血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的結(jié)合是血小板活化和血栓形成的啟始和關(guān)鍵步驟。提示CHD患者血小板高反應(yīng)性及血栓風(fēng)險(xiǎn)增加與血小板GPⅠb的糖基化水平可能存在一定的相關(guān)性。

糖尿病患者體內(nèi)血小板功能亢進(jìn)與高血糖有關(guān)，雖然抗血小板藥物可在相當(dāng)程度上抑制血小板活性，研究顯示仍有部分患者出現(xiàn)抗血小板藥物不敏感。糖尿病患者體內(nèi)多種蛋白質(zhì)(如膠原蛋白、血紅蛋白等)在高血糖狀態(tài)下均發(fā)生了非酶糖基化反應(yīng)，形成糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)，影響機(jī)體正常代謝途徑，如促進(jìn)糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化生成，導(dǎo)致內(nèi)皮調(diào)節(jié)功能受損[8]，增加血小板活性，促進(jìn)血小板聚集等。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血小板糖蛋白總的糖基化水平升高，且與患者阿司匹林不敏感相關(guān)[9]?？梢?jiàn)血小板糖基化與病程進(jìn)展及治療可能存在某種內(nèi)在聯(lián)系，從血小板糖基化的角度研究糖尿病，對(duì)病情認(rèn)識(shí)及發(fā)病機(jī)制方面都具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，去除癌細(xì)胞表面的唾液酸使其更容易被固有免疫細(xì)胞識(shí)別并消滅[10]，這可能為癌癥免疫療法提供新途徑。表明血小板糖基化修飾的研究不僅為詮釋疾病全新的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，同時(shí)也可能是出血及血栓性疾病潛在的治療靶點(diǎn)。

2 血小板糖蛋白糖基化的功能

血小板糖蛋白糖基化的異常改變可能與血小板疾病密切相關(guān)。Shah等[11]分析血小板的糖蛋白質(zhì)組學(xué)，從血小板裂解后獲得的1 296種肽鏈中鑒別出799個(gè)與N-糖鏈結(jié)合的糖基化位點(diǎn)。

2.1GPⅠb GPⅠb是血小板膜表面最豐富的糖蛋白之一，其糖基化位點(diǎn)主要位于α亞單位[相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)143 000],蛋白酶裂解后脫落到血漿中的GPⅠb片段包含2個(gè)部分：糖鏈部分(Mr 80 000)和多肽部分(含有vWF和凝血酶的結(jié)合位點(diǎn)，Mr 45 000)[12]。Hoffmeister等[13]研究發(fā)現(xiàn)以尿苷二磷酸半乳糖(uridine diphosphate-galactose,UDP-Gal)為糖基化供體，使血小板表面發(fā)生半乳糖糖基化，封閉αMβ2的識(shí)別位點(diǎn)，抑制巨噬細(xì)胞吞噬血小板，延長(zhǎng)冷藏血小板的保存期限。有學(xué)者構(gòu)建小鼠內(nèi)皮/造血干細(xì)胞中Cosmc基因定向敲除的小鼠模型(Cosmc基因編碼調(diào)節(jié)O-糖鏈的蛋白質(zhì))，發(fā)現(xiàn)該突變可導(dǎo)致大多數(shù)小鼠在圍產(chǎn)期嚴(yán)重出血而死亡，幸存小鼠尾部出血時(shí)間顯著延長(zhǎng)并發(fā)生巨血小板減少癥。該類小鼠血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ分子表達(dá)減少，與vWF結(jié)合功能及活化GPⅡb/Ⅲa的功能明顯減弱。提示廣泛的O-糖鏈對(duì)于血小板的生成、糖蛋白表達(dá)及功能的正常發(fā)揮必不可少，O-糖鏈的改變可能導(dǎo)致止血異常[14]。

2.2P選擇素 P選擇素(也稱CD62P，GMP140)是存在于血小板α顆粒膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞的糖蛋白。血小板活化后，α顆粒膜與胞膜迅速融合，使P選擇素在血小板表面瞬時(shí)表達(dá)，從而介導(dǎo)活化血小板與白細(xì)胞的反應(yīng)、促進(jìn)血栓形成。研究證實(shí)，P選擇素存在野生型(715Thr)和變異型(715Pro)2種形式。變異型P選擇素糖基化水平降低50%，其在轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面的表達(dá)和分泌也減少，與中性粒細(xì)胞樣的HL-60細(xì)胞結(jié)合降低，同時(shí)其與單核細(xì)胞的聚集體也明顯低于野生型；體外及體內(nèi)試驗(yàn)顯示變異型P選擇素阻礙其糖基化，形成不完整P選擇素，從而減少P選擇素的表達(dá)及分泌，最終影響血小板功能[15]。表明血小板P選擇的糖基化修飾差異可能在炎癥反應(yīng)中起著一定的作用。

2.3C型凝集素樣受體2(C-lectin like receptor 2，CLEC-2) CLEC-2是表達(dá)于血小板表面的受體,可識(shí)別多種配體，在血小板聚集、腫瘤轉(zhuǎn)移及HIV感染中發(fā)揮重要作用。CLEC-2存在2種不同的形式：高分子量和低分子量。二者的蛋白質(zhì)核心相同而糖鏈存在差異。研究發(fā)現(xiàn),2種類型的CLEC-2在134位天冬酰胺(Asn)存在不同的糖基化形式[16]。高分子量CLEC-2在該位點(diǎn)有巖藻糖糖鏈，且形式復(fù)雜，如雙觸角、三觸角和四觸角等形式，而低分子量CLEC-2中則沒(méi)有這些糖鏈結(jié)構(gòu)[16]。

2.4血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1，即CD31) PECAM-1主要分布于血小板、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞，是內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用的主要成分。該分子通過(guò)N端的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用，維持血管通透屏障和炎癥或血栓后的內(nèi)皮細(xì)胞重建。研究顯示，PECAM-1功能依賴于α2,6-唾液酸。缺乏α2,6-唾液酸可下調(diào)PECAM-1的酪氨酸磷酸化和募集Src(含有蛋白酪氨酸磷酸酶2)，使細(xì)胞更易發(fā)生線粒體依賴的細(xì)胞凋亡[17]。PECAM-1糖鏈占其分子量的30%，這些糖鏈主要來(lái)自于同源結(jié)合表面的25位Asn殘基；通過(guò)對(duì)該位點(diǎn)突變體(N25Q)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盡管該突變體在細(xì)胞相互作用處正常聚集，但在凝血酶破壞的內(nèi)皮細(xì)胞屏障重建功能則顯著減弱，證實(shí)包含唾液酸的糖鏈結(jié)構(gòu)(來(lái)自25位Asn)通過(guò)穩(wěn)定PECAM-1分子同源結(jié)合表面而增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)相互作用[18]。

2.5糖基轉(zhuǎn)移酶 在蛋白質(zhì)糖基化修飾過(guò)程中，糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)催化生成糖苷鍵而發(fā)揮重要作用。研究曾認(rèn)為糖基轉(zhuǎn)移酶是定位于高爾基體適當(dāng)區(qū)室中，通過(guò)外殼蛋白Ⅰ介導(dǎo)進(jìn)行逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，且僅在其莖區(qū)域的蛋白質(zhì)水解切割后才被釋放和分泌[19]。血小板是無(wú)核細(xì)胞，缺乏復(fù)雜的分泌系統(tǒng)如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。但已有研究顯示血小板有糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，人血小板是糖基轉(zhuǎn)移酶的重要攜帶者，血小板內(nèi)部和表面存在多個(gè)不同糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員，包括α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST3Gal-1)、β1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(β4GalT)、α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6Gal-1)等[20]。同時(shí)，血小板內(nèi)部也含有豐富的糖基供體，活化后釋放可溶性血小板糖基轉(zhuǎn)移酶和糖基供體到細(xì)胞外，并使附近細(xì)胞糖基化?；罨娜搜“迮cST3GalⅣ-/-缺陷小鼠血小板孵育后，小鼠血小板表面唾液酸含量增多[21]。提示血小板活化釋放的糖基轉(zhuǎn)移酶具有重塑血小板表面糖鏈、改變細(xì)胞行為的能力，可能動(dòng)態(tài)控制著血小板活化。

3 血小板糖基化的檢測(cè)方法

3.1質(zhì)譜法 質(zhì)譜法基于糖蛋白的糖鏈酶解和富集基礎(chǔ)上，可定量檢測(cè)糖鏈豐度，既可用于分辨聚糖混合物的成分，也可作為獲取糖鏈結(jié)構(gòu)信息的工具。首先純化并富集糖蛋白/糖肽，然后用胰蛋白酶及糖苷酶對(duì)糖肽加工處理、修飾，最后根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果并參照數(shù)據(jù)庫(kù)信息分析糖鏈糖基化位點(diǎn)、糖鏈結(jié)構(gòu)[2]。質(zhì)譜法是目前公認(rèn)的分析糖蛋白糖基化的方法，特別適用于分析含少量聚糖的復(fù)合混合物，但在檢測(cè)血小板糖基化時(shí)，只能分析血小板裂解后提純的糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)及糖基化水平，無(wú)法實(shí)現(xiàn)完整血小板糖蛋白糖基化修飾水平檢測(cè)，且質(zhì)譜法前處理復(fù)雜，對(duì)技術(shù)人員要求高，成本高，耗時(shí)較長(zhǎng)，后期處理分析困難等缺陷，并不能作為血小板糖基化檢測(cè)的最佳方法。目前有研究用固相萃取含糖肽段的方法(solid phase extraction of glycosite-containing peptides，SPEG)[11]或酶化學(xué)法固相萃取獲得N-糖鏈和含糖肽(solid phase extraction of N-linked glycans and glycositecontaining peptides，NGAG)[22]，iTRAQ標(biāo)記后聯(lián)用LC-MS/MS技術(shù)分析血小板糖蛋白質(zhì)組學(xué)。

3.2糖微陣列技術(shù) 糖微陣列技術(shù)(糖基因芯片)是以DNA微陣列技術(shù)為基礎(chǔ)，具有高通量和高靈敏度，可用于聚糖結(jié)構(gòu)分析。該技術(shù)是將數(shù)以千計(jì)的寡糖序列以點(diǎn)陣形式固定在特定的基板上，并通過(guò)高通量掃描技術(shù)分析糖分子與其他生物分子間的特異性相互作用，研究聚糖在生物體中的功能和作用機(jī)制。糖微陣列技術(shù)最顯著的特點(diǎn)是樣品用量小、一次性檢測(cè)樣品多，可同時(shí)分析、檢測(cè)和鑒別成百個(gè)樣品。但是糖微陣列還處于技術(shù)開(kāi)發(fā)的初級(jí)階段，在很多方面需要進(jìn)一步研究，如新的構(gòu)建方法、新的表面材料和顯影技術(shù)、進(jìn)一步微型化、靈敏的檢測(cè)技術(shù)和數(shù)據(jù)處理工具等[21,23]。

3.3基于凝集素的流式細(xì)胞分析技術(shù) 凝集素能識(shí)別糖蛋白和糖脂中，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的糖基，一種凝集素具有對(duì)某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力；同時(shí)凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合而不影響其生物活性。流式細(xì)胞分析技術(shù)具有靈敏度、特異性高，重復(fù)性好，分析細(xì)胞數(shù)量多(≥10 000個(gè)細(xì)胞)的特點(diǎn)。將二者結(jié)合產(chǎn)生的基于凝集素的流式細(xì)胞技術(shù)可用于檢測(cè)血小板及細(xì)胞表面的糖基化水平，相較于其他糖鏈分析技術(shù)，該方法樣本前處理分析過(guò)程簡(jiǎn)單，可避免人為操作造成的結(jié)果差異[24]。

4 展望

雖然糖鏈結(jié)構(gòu)通過(guò)質(zhì)譜方法可獲得較為全面的信息，但對(duì)于糖蛋白糖基化修飾差異所致細(xì)胞或機(jī)體功能的改變目前并沒(méi)有較為統(tǒng)一的研究方法。血小板離體后受外界環(huán)境影響易活化，離體修飾后難以用體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)研究糖基化修飾差異對(duì)血小板功能的影響，而這些因素均對(duì)糖基化修飾差異與血小板功能影響的研究造成了很大的困難。目前，對(duì)已明確的血小板糖蛋白糖基化修飾的功能及其對(duì)機(jī)體的影響并沒(méi)有更詳細(xì)的研究。了解血小板糖基化，有利于對(duì)血小板異常糖基化導(dǎo)致血小板功能的改變以及與疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系的進(jìn)一步研究，可為疾病的治療及診斷提供參考價(jià)值。

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10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.18

李麗萍，1992年生，女，碩士研究生，研究方向：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)。

屈晨雪，博士，副主任醫(yī)師，E-mail：qucx2012@hotmail.com。

R446.11

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2017-03-27)

王海燕)