孫 旭，馬曉昱，馬 群，高 媛，劉云云，陳 瑤

含動(dòng)物藥成分的活力膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立＊

孫 旭，馬曉昱，馬 群，高 媛，劉云云，陳 瑤＊

目的 建立含動(dòng)物藥成分的活力膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用顯微鏡法對(duì)土鱉蟲體壁碎片、剛毛、肌纖維等成分進(jìn)行觀察鑒別；薄層色譜法對(duì)活力膠囊處方中的動(dòng)物藥土鱉蟲、穿山甲進(jìn)行定性鑒別，并用凝血酶滴定法對(duì)水蛭素抗凝血酶的活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果土鱉蟲顯微鏡鑒別特征明顯，易于區(qū)分；土鱉蟲、穿山甲的供試品薄層色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；水蛭素抗凝血酶活性均值為94.2 U/g。結(jié)論該方法結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，總體較為滿意，可作為該膠囊制劑的質(zhì)量控制方法。

活力膠囊；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；水蛭素

活力膠囊是海軍青島第二療養(yǎng)院研制的純中藥制劑，含有動(dòng)物藥成分，如水蛭、穿山甲（自然死亡）、土鱉蟲等，具有活血化瘀，通經(jīng)鎮(zhèn)痛的作用，用于肝硬化，心腦血管疾病等病的治療，取得良好的治療效果。國內(nèi)對(duì)含動(dòng)物類成分的藥品和制劑的質(zhì)量控制相對(duì)薄弱。為提高含有動(dòng)物藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地控制質(zhì)量，本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立活力膠囊的定性定量檢測(cè)方法。筆者采用顯微鏡法對(duì)體壁碎片、剛毛、肌纖維進(jìn)行觀察鑒別，采用TLC法對(duì)處方中土鱉蟲、穿山甲等進(jìn)行定性鑒別，采用凝血酶滴定法測(cè)定水蛭中的水蛭素含量，為活力膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供更加完備、簡便可行、準(zhǔn)確可靠的定性定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料薄層層析硅膠G、（青島海洋化工集團(tuán)）；ZF-6型三用紫外分析儀；METTLER AE240電子天平；AS-B超聲波清洗儀；HG-B電熱恒溫干燥箱；HH-8電熱恒溫水浴鍋；奧林巴斯CX-31顯微鏡（廣州明美數(shù)碼成像系統(tǒng)）。標(biāo)準(zhǔn)品凝血酶（批號(hào)106A065，1000U/支，索來寶生物科技有限公司）、標(biāo)準(zhǔn)試劑牛纖維蛋白原（批號(hào)522A027，索來寶生物科技有限公司）、對(duì)照藥材土鱉蟲 （批號(hào)121533-201303，中國食品藥品檢定所）、穿山甲 （批號(hào)121027-201004，中國食品藥品檢定所）；活力膠囊樣品（批號(hào)20130401、20130902、20140101）；其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1土鱉蟲顯微鑒別［1-3］照顯微鑒別法試驗(yàn)，取本品內(nèi)容物適量，過四號(hào)篩，挑取少許置載玻片上，滴加水合氯醛試液，蓋上載玻片。

1.2.2土鱉蟲的鑒別［1-3］（1）供試品溶液的制備。取本品內(nèi)容物4 g，加甲醇30 ml超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，即得。（2）對(duì)照藥材溶液的制備。取土鱉蟲對(duì)照藥材，按“（1）”項(xiàng)下方法制成對(duì)照藥材溶液。（3）陰性對(duì)照品溶液的制備。取不含土鱉蟲的陰性樣品，按“（1）”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照品溶液。（4）薄層色譜鑒別。按薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-二氯甲烷-丙酮（5∶5∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。

1.2.3穿山甲的鑒別［1，4］（1）供試品溶液的制備。取本品內(nèi)容物4 g，加三氯甲烷80 ml，加熱回流4 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄? ml使溶解，即得。（2）對(duì)照藥材溶液的制備。取穿山甲對(duì)照藥材，按“（1）”項(xiàng)下方法制成對(duì)照藥材溶液。（3）陰性對(duì)照品溶液的制備。取不含穿山甲的陰性樣品，按“（1）”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照品溶液。（4）薄層色譜鑒別。按薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮（20∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以醋酐-硫酸（9∶1）混合溶液，在80℃加熱數(shù)分鐘，分別置日光和紫外燈（365 nm）下檢視。

1.2.4水蛭素（抗凝血酶）的含量測(cè)定［1，5］（1）供試品溶液的制備。取本品內(nèi)容物約1 g，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液5 ml，充分?jǐn)嚢瑁?0 min，并時(shí)時(shí)振搖，3 000 r/min離心10min，為供試品溶液。（2）牛纖維蛋白原溶液的制備。精密取牛纖維蛋白原的凝固物適量，加三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液，制成含量為0.5%的溶液（臨用前配制）。（3）凝血酶溶液的制備。取凝血酶1000 U，制備成1000 U/ml的貯備液，再取適量加0.9%氯化鈉溶液制備成40 U/ml的凝血酶溶液。（4）測(cè)定方法。精密量取供試品溶液50 μl，置試管（8 mm×38 mm）中，加入含0.5%（牛）纖維蛋白原溶液200 μl，搖勻，置水浴中（37±0.5）℃溫浸5 min，滴加每1 ml中含40 U的凝血酶溶液（每1 min滴加1次，每次1 μl，邊滴加邊輕輕搖勻）至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按下式計(jì)算：U=C1V1/C2V2；式中U為每1g含凝血酶活性單位（U/g），C1為凝血酶溶液的濃度（μ/ml），C2為供試品溶液的濃度（g/ml），V1為消耗凝血酶溶液的體積（μl），V2為供試品溶液的加入量（μl）。

2 結(jié)果

2.1 土鱉蟲顯微鑒別置顯微鏡下觀察，體壁碎片深棕色或黃色，表面有不規(guī)則紋理，其上著生短粗或細(xì)長剛毛，常可見剛毛脫落后的圓形毛窩；剛毛棕色或黃色，先端銳尖或鈍圓，有的具縱直紋理。橫紋肌纖維無色或淡黃色，常碎斷，細(xì)密橫紋。結(jié)果見圖1。

圖1 土鱉蟲顯微鑒別

2.2 土鱉蟲的鑒別結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液則無此斑點(diǎn)；噴以香草醛硫酸試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液則無此斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2。

圖2 土鱉蟲的鑒別

2.3 穿山甲的鑒別結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液則無此斑點(diǎn)；置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液則無此斑點(diǎn)。色譜詳見圖3。

圖3 穿山甲的鑒別

2.4 水蛭素的含量測(cè)定水蛭素（抗凝血酶）的含量測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 活力膠囊抗凝血酶活性

3 討論

顯微鑒別方面，剛毛、體壁碎片和肌纖維不僅具有生物學(xué)穩(wěn)定性，而且具有明顯的顯微特征，土鱉蟲為《中國藥典》收載品種，因此采用此方法進(jìn)行顯微鑒別，該方法簡便、可靠，可為活力膠囊中土鱉蟲的鑒別提供依據(jù)。薄層鑒別方面，本研究按照《中國藥典》方法對(duì)本制劑中含有的土鱉蟲和穿山甲進(jìn)行定性鑒別，結(jié)果表明，該方法簡便、可行、快捷，專屬性強(qiáng)，可用于活力膠囊的質(zhì)量控制。水蛭素測(cè)定方面，水蛭的主要藥用功效為破血通經(jīng)，消積散癥，消腫解毒，其主要活性成分為水蛭素，是從水蛭中提取的抗凝血蛋白質(zhì)，具有強(qiáng)烈的抗凝血作用，是含水蛭藥的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)［5］。

本文采用 《中國藥典》2015年版一部方法對(duì)水蛭素的含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)活力膠囊抗凝血酶的活性符合每1 g含凝血酶活性水蛭不低于16.0 U，而且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這個(gè)值。鑒于本制劑處方中還含有穿山甲、土鱉蟲等動(dòng)物藥，也具有活血散結(jié)的作用，其可能會(huì)與水蛭有協(xié)同作用，作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)中所得抗凝血酶活性結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，原因是在滴加凝血酶時(shí)，每次滴加體積已至最小刻度單位μl，每1 min滴加1次，1 μl/次，沒有辦法繼續(xù)縮小，在消耗體積相對(duì)小的情況下，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差就會(huì)相對(duì)大。

［1］國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典2015年版：一部［S］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：19，83，268．

［2］薛純盛，趙佳麗，宋珍鵬，等.活血通脈膠囊含量測(cè)定方法的探討［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2012，13（3）：206-209.

［3］紹 燕，辛俐華，孫金霞，等.鱉甲煎丸中3種昆蟲藥剛毛及體壁碎片的顯微鑒別研究［J］.中成藥，2012，34（12）：2358-2361.

［4］康阿龍，張?zhí)K蘅，張 嫻.乳癖克膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27（1）：47-49.

［5］范尚坦，李金蘭，張 勇，等.水蛭中水蛭素含量測(cè)定的改進(jìn)［J］.中國中藥雜志，2008，33（19）：2277-2279.

［2016－05－13收稿，2016－06－10修回］

［本文編輯：劉一洋］

Establishing the quality standard of Huoli Capsules containing animal components

SUN Xü①，MA Xiao-yu，MA Qun，et al.①Institute for Drug and Instrument Control of Jinan Military Region，Jinan，Shandong 250022，China

ObjectiveTo establish the quality standard for Huoli Capsules containing animal components.MethodsIntegumentary cells，Seta，myofiber were identified by microscopic identification；Groung beeltle，Pangolin in this prescription were identified by TLC；and the content of antithrombin activation was determined by titration．ResultsThe microscopic identification can be distinguished clearly and easily；the spotsin the TLC of Groungbeeltle，Pangolin were in the same color with those in the chromatograms of control articles；Detected mean value of antithrombinis activation was 94.2 U/g.ConclusionThe method used in this study is easy，accurate and reproducible．Therefore，it could be used effectively for the quality control of this capsule preparation．

Huoli Capsules；Quality standard；TLC；Hirudin

R918

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.02.022

軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)課題（14ZJZ01-2）

250022山東濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所（孫旭，馬曉昱，高媛，劉云云，陳瑤）；266071山東青島，海軍青島第二療養(yǎng)院（馬群）

陳瑤，Email：chenyao1975@163.com