閆爽，王黎穎，王聰，蘆尚德，楊佳麗，徐仰倉，2，*

（1.天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津300457；2.天津科技大學天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津300457）

色氨酸熒光猝滅法測定海帶中碘離子

閆爽1，王黎穎1，王聰1，蘆尚德1，楊佳麗1，徐仰倉1，2，*

（1.天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津300457；2.天津科技大學天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津300457）

研究碘離子對色氨酸的熒光猝滅效應，旨在建立色氨酸熒光猝滅法測定海帶中碘離子。在pH=6.0的磷酸緩沖液中，加入不同濃度的碘離子，測定色氨酸溶液的熒光光譜及強度的變化。試驗表明，色氨酸具有釋放熒光的特性，最佳激發(fā)和發(fā)射波長分別為223 nm和352 nm。碘離子對色氨酸的熒光具有猝滅作用。色氨酸濃度為10μmol/L時，碘離子對色氨酸的熒光猝滅呈線性關(guān)系，根據(jù)猝滅程度可計算出碘離子的濃度，該方法的檢測限為1.64μmol/L。根據(jù)該方法檢測了兩種海帶樣品中的碘離子，其濃度為637μg/g干重（Laminaria japonica Aresch）和621μg/g干重（Saccharina japonica）。

熒光猝滅；色氨酸；碘離子

目前，有很多測定碘離子的方法，如離子選擇電極法[1-3]、火焰原子吸收法、分光光度法[4-5]、容量法等[6]。這些方法有的選擇性、穩(wěn)定性較差，有的靈敏度低，有的對其他成分的抗干擾能力弱，有的操作復雜、準確度較差。而采用色氨酸熒光猝滅法測定碘離子的分析方法還鮮見文獻報道。色氨酸是必需氨基酸的一種，并有較高的熒光特性。本文對色氨酸與碘離子相互作用的熒光光譜進行了研究，發(fā)現(xiàn)碘離子與色氨酸在一定的條件下能使色氨酸熒光發(fā)生猝滅。據(jù)此，經(jīng)過進一步研究建立了用色氨酸作為熒光試劑測定碘離子的新方法。該方法儀器設(shè)備簡單、分析成本低、快速、靈敏度高、選擇性好，用于測定海帶中碘的含量，結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；TD20002型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；METTLER TOLEDOFE20型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；馬弗爐：黑龍江東拓儀器制造有限公司；GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

L-色氨酸（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、碘化鉀（分析純）、乙醇（95%）、氫氧化鉀（分析純）、硫酸（分析純）。

1.2 方法

1.2.1 色氨酸熒光光譜的考察確定

取4μmol/L的色氨酸溶液，加入熒光石英池中，設(shè)定兩狹縫都為5.0nm，電壓700V，掃描速度1200nm/min；以210 nm為激發(fā)波長，在200 nm～900 nm范圍內(nèi)掃描發(fā)射光譜，確定最大發(fā)射波長λem，再以此發(fā)射波長掃描激發(fā)光譜，確定最大激發(fā)波長λex，重復激發(fā)和發(fā)射掃描，直至激發(fā)和發(fā)射峰值不再變化。

1.2.2 不同濃度色氨酸溶液熒光譜性測定

15 mL反應體系。最大發(fā)射波長和最大激發(fā)波長依據(jù)上述測得的結(jié)果設(shè)定，測定濃度為1、2、3、4、5μmol/L色氨酸溶液的熒光光譜。

1.2.3 色氨酸用量的選擇

單因素試驗。在15mL體系中，色氨酸溶液5mL，碘化鉀溶液10mL，溫度25℃，反應時間30min。碘離子濃度梯度為：0、1、2、3μmol/L，控制一個碘離子濃度，改變檢測液色氨酸的濃度為5、10、15、20、25、30μmol/L。測定溶液的熒光強度。通過單因素方差分析選擇出在低濃度的碘離子（0～3μmol/L）溶液下，對檢測液色氨酸熒光影響最大的色氨酸濃度。

1.2.4 方法檢測限

測定碘離子含量的標準曲線，建立一元線性回歸方程。測定12份試劑空白，根據(jù)3S0/K（S0為空白測定值的標準偏差，K為工作曲線的斜率）進行計算，求方法檢測限[7]。

1.2.5 樣品分析

清洗干凈的海帶風干至恒重，準確稱取1 g（精確至0.000 1 g），剪碎研細，移入坩堝加入1mol/LKOH溶液2mL，充分攪拌，在電爐上碳化10min后，放入馬弗爐中600℃下灼燒30min?；曳秩苡谝欢康恼麴s水中并加熱煮沸浸取碘離子，溶液降至常溫后，用0.2 mol/L的H2SO4調(diào)節(jié)至中性，過濾，濾液用蒸餾水定容至1 000mL的容量瓶中，即成待測液。比色管中加入10mL待測液，5mL的10μmol/L的色氨酸，室溫下充分振蕩后，反應30min，測定熒光強度[8]。

1.2.6 碘量法測定海帶中碘離子的含量[9]

先將市售海帶洗凈、烘干、粉碎。準確稱取1.0 g樣品于瓷坩堝中，置于電爐上碳化至無煙，然后置入馬弗爐中逐漸升溫至600℃約30min后取出，樣品呈灰白色后取出自然冷卻，用50mL水將海帶灰置于150mL燒杯中，多次用熱水洗滌坩堝內(nèi)殘渣。然后進行過濾并將濾液和洗液移入150 mL錐形瓶中加入2 mL 0.25mol/LNaOH-KMnO4溶液搖勻放置5min，隨后加入2mL 0.2mol/L硫酸溶液，邊搖動邊加入（COOH）2溶液至溶液中高錳酸鉀的顏色恰好消失。加入5mL 2%KI溶液，溶液將變?yōu)辄S色。用0.002mol/LNa2S2O3標準溶液滴定，至溶液呈淺黃色時，加入50mL蒸餾水，再加入2mL 1%淀粉指示劑，搖勻后，繼續(xù)滴定顏色恰好消失。樣品中碘的含量的計算：

式中：21.15=M/6；A為碘的含量，mg/kg；C為Na2S2O3的濃度，mol/L；M為碘的相對原子質(zhì)量；V為Na2S2O3標準溶液用量，mL；W為海帶的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 色氨酸的熒光光譜

圖1是色氨酸的激發(fā)光和發(fā)射光的掃描圖譜。

圖1 色氨酸的激發(fā)和發(fā)射光譜Fig.1 The fluorescence excitation spectra of tryptophan（a）and its emission spectra（b）

從圖譜可知，色氨酸有兩個激發(fā)波長，分別為223 nm和270 nm，發(fā)射波長為352 nm，前人[10]也有類似的研究報道。波長越短，能量越大，若分別用223 nm和270 nm的光照射色氨酸時，前者發(fā)射的熒光強度要大于后者，這與我們的試驗結(jié)果相符，說明以223 nm為激發(fā)光時，色氨酸發(fā)射熒光的靈敏度高于以270 nm為激發(fā)光的靈敏度。另外，楊晉等[11]報道，激發(fā)光與發(fā)射光的波長相差越小，色氨酸的熒光強度越容易受干擾，當二者的差大于90時，色氨酸才能被有效測定。綜上所述，我們選擇了色氨酸的激發(fā)波長223 nm，發(fā)射波長352 nm。

2.2 色氨酸濃度對其熒光光譜的影響

圖2為不同濃度色氨酸溶液的熒光光譜。

圖2 不同濃度色氨酸的熒光光譜Fig.2 Different concentrations of tryptophan fluorescence spectrum

從圖2中得出，色氨酸濃度對最大激發(fā)和發(fā)射波長無明顯影響。表明熒光是色氨酸的一種特性。

2.3 色氨酸用量

研究不同濃度色氨酸檢測液與碘離子的反應。在15mL體系中，設(shè)定熒光儀參數(shù)：同步模式，EM Start WL（發(fā)射起始波長）223 nm，EM End WL（發(fā)射終止波長）400 nm，EMWL（發(fā)射波長）352 nm，兩狹縫均選5.0 nm，電壓：700V，響應時間4.0 s。重新設(shè)定合適的量程。表1為不同濃度的色氨酸強度的單因素方差分析表，通過單因素方差分析，10μmol/L色氨酸的p=p（f=29.33）＜0.01，在顯著水平α=0.05下不同濃度碘離子溶液（0～3μmol/L）對10μmol/L濃度的色氨酸熒光猝滅效果最強。因此，選擇10μmol/L的色氨酸溶液為最佳檢測濃度。

表1 不同濃度的色氨酸熒光強度的單因素方差分析Table 1 One-Way ANOVA Analysis of tryptophan fluorescence at different concentrations

2.4 線性范圍和方法檢測限

2.4.1 熒光法測定碘離子含量的標準曲線

用熒光分光光度法分別測定1μmol/L～5μmol/L碘化鉀與10μmol/L的色氨酸反應后溶液的熒光強度，圖3為熒光分光光度法測定碘離子含量的標準曲線。標準曲線方程為F0/F=0.038 5[I-]+1.005 7（式中：F0為空白樣的熒光強度，即色氨酸溶液的熒光強度；F為添加碘化鉀30min后溶液的熒光強度；[I-]為碘離子的濃度），相關(guān)系數(shù)為0.999 7。線性關(guān)系良好。

圖3 熒光分光光度法測定碘離子含量的標準曲線Fig.3 The standard curve for the determination of iodine ion content by fluorescence method

2.4.2 空白試驗

向12支標記好的比色管中分別加入10mL蒸餾水和5mL的10μmol/L的色氨酸檢測液，同上設(shè)定熒光分光光度計的相關(guān)參數(shù)，配置好的空白溶液充分振蕩反應30min后，測定出空白實驗的的熒光強度F，測定結(jié)果見表2。

表2 空白試樣的熒光強度Table2 Fluorescence intensity of blank sample

F0=3 955，空白試樣的標準偏差為0.021。

方法檢測限[7]=3空白標準偏差/斜率=1.64μmol/L。

方法檢出限為1.64μmol/L，在線性范圍內(nèi)1.64μmol/L～5μmol/L，可直接用于含碘量高的海產(chǎn)品中碘含量的測定。

空白試驗一定程度上可以校正誤差，分析誤差來源。國際純粹與應用化學聯(lián)合會（IUPAC）1997年通過，1998年發(fā)表的《分析術(shù)語綱要》（IUPAC Compendium of Analytical Nomenclature）中規(guī)定：“檢出限以濃度（或質(zhì)量）表示，是指由特定的分析步驟能夠合理地檢測出的最小分析信號XL求得的最低濃度cL（或質(zhì)量qL）”。空白值和檢出限與整個分析體系有關(guān)，即與分析方法、樣品制備和測定、環(huán)境、儀器及其靈敏度、試劑、分析人員等有關(guān)[12]。

色氨酸溶液的熒光強度對環(huán)境的敏感性較高，可能是由于影響了吲哚環(huán)微環(huán)境的變化[13]。根據(jù)空白試驗結(jié)果分析，系統(tǒng)誤差可能原因是儀器噪聲或?qū)嶒灜h(huán)境中的噪聲影響儀器測量熒光值的波動；色氨酸及碘化鉀溶液配制時的儀器誤差和人為誤差；空氣或水中的某些物質(zhì)可能造成色氨酸熒光強度的變化等。

2.5 海帶提取液中碘離子含量測定

實驗測定了兩種市售海帶Laminaria japonica Aresch（L）和Saccharina japonica（S）中碘離子的含量，通過堿碳化法，將海帶中的碘離子全部轉(zhuǎn)化為無機碘離子并溶于水溶液中。利用熒光分光光度法測定了海帶樣品的水溶液與色氨酸檢測液反應后的熒光強度。依據(jù)標準曲線方程，求出海帶樣品的水溶液中碘離子濃度，繼而計算出海帶樣品中的碘離子含量，測定結(jié)果見表3。

表3 海帶樣品的碘含量的計算Table3 The calculation of kelp iodine ion content of sample

由表3可知，Laminaria japonica Aresch樣品（L）的平均碘含量為637μg/g，Saccharina japonica樣品（S）的平均碘含量為621μg/g。

2.6 碘量法測定海帶樣品中碘離子的含量

準確稱取海帶按1.2.6處理，然后把其溶液定容于100mL容量瓶中。取20.00mL試液進行平行測定，結(jié)果見表4。

表4 碘量法測定海帶中碘的含量Table4 Determining of the content of iodine in the kelp-iodim etry

由表4可知，用碘量法測定的Laminaria japonica Aresch樣品（L）的平均碘含量為639.72μg/g，Saccharina japonica樣品（S）的平均碘含量為622.66μg/g。

3 結(jié)論

Fan[14]研究了[Omim]Cl（一種離子化合物，分子式為C12H23N2Cl）與色氨酸反應的熒光特性，結(jié)果表明[Omim]Cl對色氨酸的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。L-色氨酸與[Omim]Cl中的Cl-之間的反應是自發(fā)的，但是作用程度較為微弱，范德華力和氫鍵是主要結(jié)合力。碘與氯屬同一主族，在原子半徑、得失電子能力等方面呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。碘化鉀與[Omim]Cl一樣，也屬離子化合物，因此，碘化鉀中的I-對色氨酸熒光的猝滅機理與[Omim]Cl的相似，也應屬靜態(tài)猝滅。

在pH=6.0的磷酸緩沖液介質(zhì)下，碘離子能使色氨酸的熒光猝滅，就此建立了用色氨酸作為熒光試劑測定碘離子的新方法。用該方法測定的兩種海帶樣品中的碘與應用碘量法測定的結(jié)果相近。該方法儀器設(shè)備簡單、分析成本低、快速、靈敏度高、檢出限低、選擇性好，用于測定海帶中碘的含量，結(jié)果令人滿意。

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Tryptophan Fluorescence Quenching Method for Determination of Iodine in Kelp Ions

YAN Shuang1，WANG Li-ying1，WANG Cong1，LU Shang-de1，YANG Jia-li1，XU Yang-cang1，2，*
（1.College of Marine and Environmental Sciences，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The novelmethod of determining iodide ion content in kelp was established by the reaction of iodide ionquenchingtryptophan fluorescenceintensity.Under phosphate buffer medium at pH=6.0，adding different concentrations of iodide into fluorophore solutions with given concentrations，fluorescence intensives were measured，tried several type of fluorophores，found tryptophan hadcharacteristics of fluorescence releasing.Experiments showedthat the fluorescence optimum excitation spectra of tryptophan and its emission spectra were 223 nm and 352 nm.When the concentration of tryptophan was10μmol/L，the iodide ionhad a liner relation of tryptophan fluorescence quenching.According to the degree of quenching couldcalculate the concentration of the iodide ion，the detection limit was 1.64μmol/L.Two kinds of kelp was tested according to the method.In Laminaria japonica Aresch the concentration of the iodide ion was 637μg/g，and it was 621μg/g in Saccharina japonica.

fluorescence quenching；tryptophane；iodide ions

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.030

2016-05-06

天津市科技興海項目（KJXH2012-14）；天津市大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201610057085）

閆爽（1991—），女（漢），研究生，研究方向：海洋生物資源利用研究。

*通信作者