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（1.新鄉(xiāng)縣小冀鎮(zhèn)人民政府便民服務(wù)中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院）

多重PCR技術(shù)在雞病毒性傳染病診斷中的應(yīng)用研究進(jìn)展

姬中鋒1，李夢(mèng)麗2，葛亞明2*，趙樸2*

（1.新鄉(xiāng)縣小冀鎮(zhèn)人民政府便民服務(wù)中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院）

多重PCR（multiplex PCR，mPCR），是由普通PCR延伸而來(lái)的一項(xiàng)PCR技術(shù)，在同一PCR反應(yīng)體系里加入兩對(duì)或兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)目的核酸片段的PCR反應(yīng)。因其可在單一PCR體系中，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段，多重PCR不僅保留了普通PCR特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，而且具有節(jié)約時(shí)間、節(jié)省人力物力等優(yōu)點(diǎn)（趙樸等，2014），因此，多重PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)的多個(gè)領(lǐng)域，包括基因多態(tài)性分析、基因突變位點(diǎn)檢測(cè)、基因缺失分析及病原體核酸檢測(cè)等。隨著規(guī)?；B(yǎng)雞業(yè)的快速發(fā)展，雞傳染病的發(fā)生越來(lái)越復(fù)雜，混合或繼發(fā)感染日益多發(fā)，特別病毒混合或繼發(fā)感染更為常見(jiàn)，為方便、快速診斷混合或繼發(fā)感染，多重PCR技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于雞病毒性傳染病的診斷中，現(xiàn)就多重PCR在雞病毒性傳染病診斷中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以供參考。

1 雞呼吸道傳染病診斷

引起雞呼吸道傳染病的病毒很多，如新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）和傳染性支氣管炎病毒（IBV）等，而且這些病毒常常混合或繼發(fā)感染，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也給獸醫(yī)臨床診斷造成了重要障礙，多重PCR技術(shù)的應(yīng)用有效解決了這一難題。

為有效檢測(cè)禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒，黃淑堅(jiān)等（2006）利用分子生物學(xué)方法,選擇禽流感病毒的M基因、新城疫病毒的F基因以及傳染性支氣管炎病毒的N基因,分別在基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,利用所合成的3對(duì)引物對(duì)相應(yīng)靶基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,建立禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎病毒多聯(lián)RT-PCR的檢測(cè)方法，結(jié)果表明：這3對(duì)引物分別能特異性地?cái)U(kuò)增出禽流感病毒的M基因片段、新城疫病毒的F基因片段及傳染性支氣管炎病毒的N基因片段,大小分別為385 bp、520 bp和748 bp。為使檢測(cè)更加簡(jiǎn)便，趙建梅等（2003）建立了一步法多重RT-PCR檢測(cè)新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎病毒。王非等（2007）建立了可同時(shí)檢測(cè)雞ILV、IBV、NDV和AIV多重RT-PCR，試驗(yàn)結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的4對(duì)引物可對(duì)同一樣品中的ILV、IBV、NDV和AIV進(jìn)行特異性擴(kuò)增，所擴(kuò)增的目的片斷的長(zhǎng)度分別為620 bp（ILV）、445 bp（IBV）、344 bp（NDV）和240 bp（AIV）；建立的RT-PCR檢測(cè)方法能夠檢測(cè)出10 pg AIV、1 ng NDV和10 ng IBV的RNA及100 pg ILV的DNA。隨后，Rashid等（2009）建立了同時(shí)檢測(cè)的H7、H9和H5 3種常見(jiàn)亞型AIV及NDV、IBV和ILTV3種常見(jiàn)呼吸道病毒的多重PCR，該多重PCR能快速鑒別H7、H9和H5，對(duì)于控制疾病AIV在雞群和人群中傳播非常重要，同時(shí)該多重PCR能鑒定雞群混合感染中3種常見(jiàn)呼吸道病毒，因此有助于降低這些病毒造成的經(jīng)濟(jì)損失。

多重PCR可有效鑒定病毒亞型。wu等（2013）建立了檢測(cè)A型流感病毒及H1、H3、H5和H9亞型AIV的多種PCR，A型流感病毒、H1、H3、H5和H9亞型AIV的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為239 bp、612 bp、187 bp、338 bp和289 bp，敏感性和傳統(tǒng)PCR敏感性相當(dāng)，該方法是快速、方便、廉價(jià)地大規(guī)模篩選臨床樣品的有效工具。

2 雞免疫抑制病診斷

免疫抑制病病毒如馬立克氏病病毒（MDV）、法氏囊病病毒（IBDV）、白血病病毒（ALV）、傳染性貧血病毒（CIAV）、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒REV）、呼腸孤病毒（ARV）等，不僅引起病雞的死亡、淘汰，而且會(huì)引起免疫抑制，導(dǎo)致感染雞免疫失敗，并且免疫抑制病毒常見(jiàn)于混合或繼發(fā)感染，給養(yǎng)雞業(yè)造成了重要經(jīng)濟(jì)損失。多重PCR是檢測(cè)雞免疫抑制病毒的有效手段。

為有效檢測(cè)雞群中的ARV、REV與ALV，畢研麗等（2012）建立了三重PCR，試驗(yàn)結(jié)果表明，該三重PCR方法可對(duì)同一樣品中的ARV、REV、ALV進(jìn)行特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物分別為247 bp、675 bp和467 bp，檢測(cè)敏感性分別為10 pg的ALV、1pg的ARV和10 pg的REV模板。為鑒定ALV的亞群，管宏偉等（2012）建立了能特異性檢測(cè)禽白血病病毒A、B、J亞群的多重PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為195、260、924 bp，檢測(cè)的最小拷貝數(shù)是103，為禽白血病病毒感染的臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查研究提供了有效手段。

3 小結(jié)

雞病毒性傳染病的種類多、傳播快、流行廣，給國(guó)內(nèi)外養(yǎng)雞業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，特別是伴隨養(yǎng)雞業(yè)的規(guī)?；图s化發(fā)展，多種病毒引發(fā)的混合感染或繼發(fā)感染在雞群中越來(lái)越常見(jiàn)，給雞病毒性傳染病的臨床診斷造成了重要障礙。在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的多重PCR技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病毒，不僅省時(shí)省力，節(jié)約單個(gè)病毒的檢測(cè)成本，而且可以提高樣本的使用率，在雞病毒性傳染病的診斷研究方面取得的重要進(jìn)展，正如前文所述，在雞呼吸道傳染病、雞免疫抑制病方面已經(jīng)建立了有效的多重PCR方法。然而，多重PCR體系中多對(duì)引物間的相互干擾和非特異性擴(kuò)增，限制了多重PCR的敏感性和特異性，為此，已有科研人員開(kāi)發(fā)了新的多重PCR技術(shù)，如雙啟動(dòng)寡核苷酸引物技術(shù)、多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)和靶序列富集多重PCR等，這些技術(shù)有效提高了多重PCR的敏感性和特異性。相信，伴隨多重PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)，會(huì)有越來(lái)越多的多重PCR方法應(yīng)用于雞病毒性傳染病的診斷研究中，為養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展保駕護(hù)航。□

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：1004-5090（2017）01-0048-02