（南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 南陽 473000）

轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲作為疫苗活載體的研究進(jìn)展

胡云，楊紅玉

（南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 南陽 473000）

雞球蟲?。╟occidiosis）病原為艾美爾屬（Eimeria）球蟲，是頂復(fù)門（Phylum Apicomplexa）原蟲中的一大類，屬于艾美爾科（Eimeriidae），艾美爾屬（Eimeria）。雞球蟲病是危害養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，每年給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來超過30億美元的經(jīng)濟(jì)損失。

1 艾美爾球蟲與動物機(jī)體的免疫

艾美爾球蟲屬于腸道上皮細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲，球蟲感染宿主細(xì)胞后，在帶蟲空泡內(nèi)完成體內(nèi)發(fā)育階段。早期研究認(rèn)為帶蟲空泡是宿主免疫系統(tǒng)和球蟲接觸的屏障，弓形蟲只允許分子量小于1 300 D的蛋白出入帶蟲空泡，而越來越多的研究表明，帶蟲空泡是球蟲抗原與宿主接觸的一種途徑，帶蟲空泡膜與宿主的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜融合，從而將帶蟲空泡內(nèi)的抗原成分分泌至宿主胞漿。此外，子孢子、裂殖子和配子反復(fù)入侵腸黏膜上皮細(xì)胞，多次刺激宿主的免疫系統(tǒng)，也是宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的重要因素。就是這種特殊的生活史導(dǎo)致蟲體對腸黏膜上皮細(xì)胞的反復(fù)入侵，進(jìn)而能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生堅(jiān)實(shí)的保護(hù)性細(xì)胞免疫和黏膜免疫。

機(jī)體黏膜部位（如腸道、呼吸道、泌尿生殖道）能夠通過多重機(jī)制保護(hù)宿主免受病原體的入侵：其固有的緊密結(jié)構(gòu)如上皮細(xì)胞層間的連接和管腔的密閉微環(huán)境，為機(jī)體抵抗病原感染提供了機(jī)械性的保護(hù)屏障，但是仍有許多病原能夠突破黏膜上皮的屏障，進(jìn)入腸黏膜細(xì)胞激發(fā)特異性免疫反應(yīng)；此外，在機(jī)體的黏膜部位，存在大量的抗原遞呈細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，T細(xì)胞經(jīng)樹突狀細(xì)胞活化后，刺激B細(xì)胞分泌IgA抗體，后者能夠?qū)Σ≡w發(fā)揮中和作用。

雞球蟲主要經(jīng)腸道感染，能夠激發(fā)宿主產(chǎn)生高效的黏膜免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫。而禽流感、新城疫等禽類重要傳染病也主要經(jīng)腸道和呼吸道傳播，這是設(shè)想利用轉(zhuǎn)基因球蟲防治禽流感、新城疫等禽類重要傳染病的立腳點(diǎn)。病毒入侵機(jī)體后主要在消化道和呼吸道部位繁殖擴(kuò)增，因而宿主產(chǎn)生的免疫分子和免疫細(xì)胞主要靶向消化道及呼吸道黏膜；而艾美耳球蟲免疫能夠誘導(dǎo)雞產(chǎn)生以腸黏膜免疫應(yīng)答為主的共同黏膜免疫反應(yīng)，即腸黏膜部位的特異性的IgA+漿細(xì)胞和T細(xì)胞可趨化至呼吸道等其他黏膜部位，產(chǎn)生異位保護(hù)力。艾美耳球蟲不同階段的蟲體反復(fù)入侵腸道細(xì)胞，這時(shí)如果表達(dá)外源蛋白，外源蛋白也會跟隨蟲體反復(fù)入侵腸細(xì)胞而激發(fā)強(qiáng)大的黏膜免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此研發(fā)出高效的黏膜免疫疫苗-轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲疫苗有非常重要的意義。

黏膜部位微環(huán)境復(fù)雜，因此黏膜疫苗發(fā)揮效果困難重重，黏膜疫苗在進(jìn)入黏膜部位遞呈給抗原細(xì)胞之前要面臨上皮層的機(jī)械屏障和各種蛋白酶的消化作用，因此迫切需要黏膜佐劑提高腸道部位對黏膜疫苗的免疫反應(yīng)。霍亂毒素（Cholera toxin）和大腸桿菌不耐熱腸毒素（E.coli heat-labile enterotoxin）是近幾年來研究比較熱的兩種黏膜佐劑。這些新型黏膜佐劑的開發(fā)為防治經(jīng)黏膜部位感染的傳染病提供了無限前景。

2 轉(zhuǎn)基因球蟲作為疫苗活載體的優(yōu)勢

艾美耳球蟲具有嚴(yán)格的宿主特異性，一種球蟲只感染一種動物，而且球蟲入侵腸道細(xì)胞后，僅僅在帶蟲空泡內(nèi)發(fā)育，與宿主細(xì)胞核隔離，球蟲的基因片段插入或整合進(jìn)宿主基因組的可能性較小。

基因組容量大（約60Mb），可供外源基因的插入位點(diǎn)多。

艾美耳球蟲為真核生物，可以對表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行糖基化修飾。這樣表達(dá)出的外源蛋白能夠更好地激發(fā)宿主免疫反應(yīng)。

免疫原性強(qiáng)、可激發(fā)產(chǎn)生共同黏膜免疫反應(yīng)：由于很多禽類重要傳染病都是經(jīng)腸道傳播，而球蟲疫苗在田間的保護(hù)率≥90%，艾美耳球蟲能激發(fā)起高效的腸道黏膜免疫應(yīng)答。因此轉(zhuǎn)基因球蟲可以在宿主發(fā)揮抗球蟲免疫的同時(shí)，激發(fā)對其他病原的免疫反應(yīng)，達(dá)到“一苗多用”的效果。自然飼養(yǎng)條件下卵囊可以重復(fù)感染，免疫一次即相當(dāng)于多次預(yù)防接種。

球蟲作為疫苗載體，可以口服接種，簡單易行。因?yàn)槁涯冶谀軌虮Ｗo(hù)它抵抗嗉囊和胃等酸性環(huán)境，不降低疫苗的活性。適用于群體飲水免疫或拌料免疫；球蟲的繁殖周期較短，且感染屬于自限性，在生成卵囊以后即排到體外，不會引起免疫耐受問題。

生物安全性高。雞球蟲各個(gè)種均以雞為惟一宿主，不會跨種間傳播，因此轉(zhuǎn)基因球蟲在田間的釋放不造成所謂“散毒”的局面。

3 轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲作為疫苗活載體的研究進(jìn)展

1998年英國的Tomley研究小組利用微線體1基因的調(diào)控序列作為啟動子首次實(shí)現(xiàn)了以β-半乳糖基因（lacZ）為報(bào)告基因的柔嫩艾美耳球蟲的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并觀察到轉(zhuǎn)染子孢子可以在MDBK細(xì)胞上發(fā)育到第一代裂殖子。開啟了艾美爾球蟲轉(zhuǎn)基因研究的序幕。

2007年郝力力以球蟲本身的序列為啟動子，用黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白作為報(bào)告基因，以卵囊階段提取的基因組DNA為模板，用PCR的方法，得到相關(guān)蛋白的啟動子及肌動蛋白的下游調(diào)控序列。最終實(shí)現(xiàn)能夠表達(dá)黃色和紅色熒光蛋白的柔嫩艾美耳球蟲的瞬間轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后的子孢子在MDBK細(xì)胞上能夠發(fā)育到第一代裂殖子。

2008年閆文朝首次利用熒光報(bào)告基因和藥物篩選壓力獲得了能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的艾美耳球蟲系，并且獲得了穩(wěn)定表達(dá)黃色熒光蛋白和乙胺嘧啶抗性基因的轉(zhuǎn)基因球蟲系（TE1）。并對TE1繁殖力、致病力和免疫原性等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因球蟲TE1卵囊孢子化后，1個(gè)卵囊內(nèi)的4個(gè)孢子囊并非全部表達(dá)黃色熒光蛋白。球蟲在合子減數(shù)分裂過程中存在同源或異源染色體重組和基因轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，使表達(dá)外源抗原基因的轉(zhuǎn)基因球蟲在傳代遞增過程中比例下降。

2008年劉賢勇通過引入限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合技術(shù)（REMI）使球蟲的轉(zhuǎn)染效率提高了200倍，為轉(zhuǎn)基因球蟲的穩(wěn)定篩選建立轉(zhuǎn)基因球蟲系奠定了良好的基礎(chǔ)，他同時(shí)首次進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因球蟲系的安全性評估。

2011年黃驍舾建立了轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲激發(fā)的宿主免疫反應(yīng)的檢測平臺，它建立的一株能夠?qū)ⅫS色熒光蛋白打靶到微線中的轉(zhuǎn)基因球蟲能夠激發(fā)宿主產(chǎn)生更高的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和顯著IgA反應(yīng)，為轉(zhuǎn)基因球蟲成為新型疫苗載體展現(xiàn)了良好的前景。

2011年殷光文嘗試在同一個(gè)質(zhì)粒載體中將黃色熒光蛋白基因置于mic1啟動子和actin的3′調(diào)控序列之間構(gòu)建成一個(gè)表達(dá)框，而將紅色熒光蛋白基因置于Actin的5′和3′調(diào)控序列之間構(gòu)建成另一個(gè)表達(dá)框，成功地建立了雙框表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了不同外源蛋白同時(shí)表達(dá)，對轉(zhuǎn)基因球蟲成為新型活疫苗載體至關(guān)重要。

2012年Fiona M.Tomley和Damer P.Blake將空腸彎曲桿菌的保護(hù)性抗原CjaA轉(zhuǎn)染到柔嫩艾美耳球蟲中，建立了穩(wěn)定表達(dá)空腸彎曲桿菌CjaA的轉(zhuǎn)基因球蟲系，將該球蟲系免疫雞后用空腸彎曲桿菌攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因球蟲免疫的雞群能夠抵抗空腸彎曲桿菌的感染。

4 存在的問題及未來發(fā)展趨勢

盡管當(dāng)前艾美爾球蟲作為疫苗活載體的研究已經(jīng)取得了一些突破性的進(jìn)展，但是在轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)和轉(zhuǎn)基因球蟲的應(yīng)用上仍然存在著很多問題。直接轉(zhuǎn)染卵囊將成為未來的研究方向，它可以省去子孢子提取及外科手術(shù)途徑接種等步驟，簡單易行。

當(dāng)前艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因的挑戰(zhàn)還在于如何提高轉(zhuǎn)染效率和提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率，可以利用轉(zhuǎn)座子元件進(jìn)一步提高艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)染效率，從而提高轉(zhuǎn)基因成功的可能性。另外在艾美爾球蟲轉(zhuǎn)基因研究中將可能采用基于類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）、基于CRISPR/ Cas9的基因編輯技術(shù)等新的手段。

艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因研究取得的重要成就為其防治藥物及疫苗的研發(fā)描繪了光明的前景，假以時(shí)日，基于轉(zhuǎn)基因球蟲的活載體疫苗將不僅能實(shí)現(xiàn)球蟲病的有效防控，還有望成為預(yù)防畜禽其他重大疫病的多價(jià)疫苗?！?/p>