徐靜　張洪柱　徐玉芬

[摘要] 目的 研究分析結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移與血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）表達之間的相關性。 方法 選擇2014年1月～2015年12月間我院收治的23例結(jié)直腸癌患者進行本次研究，采集其血液樣本。根據(jù)是否出現(xiàn)了遠處轉(zhuǎn)移進行分組，將其中無遠處轉(zhuǎn)移的樣本設為對照組，共11例；發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的樣本設為觀察組，共12例。所有樣本都采用蛋白免疫印跡方法對TTR 表達進行半定量分析。 結(jié)果 通過計算兩組樣本的光密度比值，結(jié)果顯示無遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者血清樣本（對照組）中TTR的表達量更高，顯著高于發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移患者（觀察組）血清TTR表達量，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.023<0.05）。 結(jié)論 結(jié)直腸癌患者血清TTR的表達水平與腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有相關性，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者血清TTR表達量顯著更低，在今后對結(jié)直腸癌浸潤與轉(zhuǎn)移水平的評估中，TTR可作為一種腫瘤標志物。

[關鍵詞] 血清TTR；結(jié)直腸癌；相關性；表達水平

[中圖分類號] R735.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）30-0016-04

轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR），也被稱為“前白蛋白”，英文簡稱PA，是由4個相同亞基共同構(gòu)成的一種四聚體，每個亞基由127個氨基酸組成，其主要功能是以轉(zhuǎn)運蛋白的身份參與轉(zhuǎn)運甲狀腺素、視黃醇，同時TTR還能夠體現(xiàn)體內(nèi)蛋白的合成情況，當體內(nèi)蛋白丟失，出現(xiàn)應激狀態(tài)時，TTR水平會迅速下降，反之則增高[1]。由于TTR是一種甲狀腺素與視黃醇的轉(zhuǎn)運蛋白，所以其表達情況可體現(xiàn)機體的營養(yǎng)及某些病理改變，可作為預測疾病、判斷疾病預后的一項指標[2]。為此，我院選取2014年1月～2015年12月間所收治的結(jié)直腸癌住院患者進行研究，分析發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移與未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移患者TTR的表達情況，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入我院2014年1月～2015年12月結(jié)直腸癌住院患者23例為研究對象，所有患者均經(jīng)病理確診，經(jīng)檢查均未發(fā)現(xiàn)其他惡性腫瘤與甲狀腺代謝疾病。采集血清樣本，其中11例患者未出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，12例患者伴有遠處轉(zhuǎn)移（均屬于肝或者胃轉(zhuǎn)移），患者年齡最小48歲，最大79歲，平均（69.1±3.1）歲，其中男12例，女11例。全部患者于術前采集血清樣本，術前均未進行放射治療、化療與免疫治療，全部患者臨床資料均齊全。血清樣本均置于-80℃保存，采用全自動生化儀對血清蛋白濃度進行檢測。

1.2方法

對23例患者血清采用蛋白免疫印跡半定量檢測。①吸取30 μL血清標本，采用SDS-PAGE，變性溫度設置為100℃，處理時間設置為18 min。②電泳濃縮膠電壓設置為60 V，分離膠電壓設置為120 V。90 min半干電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜，采用封閉液進行封閉，封閉液采用5%脫脂奶粉+PBST；封閉一抗，封閉液采用抗體稀釋劑，TTR抗體：封閉液=1∶1000，β-actin抗體：封閉液=1∶400，在4℃下過夜；PBST：0.05% Tween+PBS，每20分鐘對膜進行一次清洗，共清洗3次。封閉二抗，TTR抗體與β-actin抗體分別采用山羊抗兔（LgG H+L）辣根過氧化物酶抗體與山羊抗小鼠（LgG H+L）辣根過氧化物酶抗體，其中TTR抗體：封閉液=1∶1500，β-actin抗體：封閉液=1∶2000，將其放置在溫室搖床孵育，時間設置為90 min，PBST每15分鐘進行一次洗膜，共進行3次，采用DBA顯色液對膜顯色5 min[3]。然后采用分析軟件Image J進行條帶光密度的計算和分析。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件對獲得的計量資料、計數(shù)資料進行統(tǒng)計處理，伴有遠處轉(zhuǎn)移組與未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移組的計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，顯著水平95%，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 有遠處轉(zhuǎn)移與無遠處轉(zhuǎn)移組患者血清TTR的表達結(jié)果比較

采集11例未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者血清，實驗以5或6例為一組，采用Western blotting雜交實驗對血清中的TTR 進行測定，實驗以β-actin 為內(nèi)參，結(jié)果見圖1。同樣方法，運用雜交實驗半定量分析12例發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者血清中TTR表達，結(jié)果見圖2。

2.2遠處轉(zhuǎn)移與無遠處轉(zhuǎn)移組結(jié)直腸癌患者血清TTR半定量結(jié)果比較

比較遠處轉(zhuǎn)移與無遠處轉(zhuǎn)移組結(jié)直腸癌患者血清TTR 與β-actin光密度值，β-actin 為參考標準，對比分析兩類患者血清TTR的表達量相對變化，同時計算TTR 的變化相對比率。統(tǒng)計學分析顯示，比較發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者（觀察組）與未出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者（對照組）血清中TTR 的表達量，前者為（3.6±0.8），后者為（11.4±3.5），發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者血清TTR表達量顯著更低，二者差異有統(tǒng)計學意義（t=7.524，P=0.023<0.05）。

3 討論

轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）也被稱為前白蛋白（PA），合成于肝臟與脈絡叢，負責轉(zhuǎn)運人體內(nèi)甲狀腺素、視黃醇蛋白并參與維生素A 的代謝。甲狀腺結(jié)合前清蛋白，屬于血漿運輸?shù)鞍祝饕撠熮D(zhuǎn)運維生素A與蛋白和甲狀腺素結(jié)合。甲狀腺結(jié)合前清蛋白主要于肝臟、眼睛和脈絡膜中產(chǎn)生，在人體血漿及腦脊髓液中有分布[4]。在pH=7.2的生理條件與環(huán)境下，TTR是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其基本結(jié)構(gòu)及其功能均是穩(wěn)定的[5]。當TTR發(fā)生分解成為單體后，將會導致淀粉變性病[6]。與正常人血清中TTR表達量比較，惡性腫瘤患者血清中的TTR表達量往往體現(xiàn)為低表達。相關研究結(jié)果表明，與正常人相比，在肝癌、肺癌患者中TTR表達呈下降態(tài)勢[7-8]，所以，在惡性腫瘤中TTR 基因具有抑癌基因的作用。通過查閱大量的文獻資料，有關惡性腫瘤TTR表達的研究報道指出，在惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展的過程中，TTR起到了腫瘤抑制物的作用，對腫瘤有抑制作用[9-10]。國外相關研究報道指出，通過對比結(jié)直腸癌患者與正常人的血清蛋白差異點，結(jié)果顯示二者在TTR 的表達上存在顯著的差異，但對比CEA陰性與陽性患者血清蛋白差異點，結(jié)果顯示并無顯著性差異[11-12]。在結(jié)直腸癌的診斷中，TTR可作為標志物，研究顯示，血清蛋白優(yōu)勢更加明顯。當前在惡性腫瘤的分期和分級中，有關TTR的報道較少，有關研究指出結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的與未出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的TTR表達量并沒有顯著差異[13-14]。上述研究結(jié)果顯示，TTR基因具有抑制癌癥的作用，而結(jié)直腸癌的發(fā)展與TTR表達存在一定的聯(lián)系，并且不同分期中TTR蛋白的表達存在明顯的差異，預示著TTR的診斷價值。

本研究選擇2014年1月～2015年12月我院所收治的結(jié)直腸癌患者作為研究對象，實驗結(jié)果表明，對比沒有出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者血清中的TTR表達，出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者血清中TTR的表達呈明顯下降態(tài)勢，對比分析兩類患者血清TTR的表達量相對變化，計算TTR 的變化相對比率。遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者TTR 的變化相對比率為（3.6±0.8），與未出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者TTR 的變化相對比率（11.4±3.5）比較顯著更低，此結(jié)果提示對TTR表達水平的研究可作為一種重要的標志物來推斷結(jié)直腸癌的發(fā)生與進展[15-17]。

TTR參與到甲狀腺素、視黃醇的轉(zhuǎn)運當中，目的在于保證體內(nèi)甲狀腺素、視黃醇以及結(jié)合蛋白水平處于正常水平[18]。TTR有很多種突變體，突變體的存在會造成多種疾病發(fā)生，其與細胞本身的變異、疾病的發(fā)生與發(fā)展緊密相關?，F(xiàn)階段大部分惡性腫瘤的治療的關鍵就在于早期診斷，這對腫瘤研究起著巨大的作用。結(jié)合國內(nèi)外相關研究，主張TTR檢測可對多種惡性腫瘤進行預測，因此被認定是一種良好的標志物，用于惡性腫瘤的診斷具有很高的價值[19]。當前其他腫瘤相關研究并未提及惡性腫瘤在TTR基因結(jié)構(gòu)上存在異常，用于體外轉(zhuǎn)染癌細胞是否能夠抑制其生長并無定論，且對TTR具體影響腫瘤的機制也尚待研究[20-21]。當前針對TTR與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關系的研究樣本數(shù)量并不多，結(jié)果也有待進一步的研究，通過對TTR及其突變體在腫瘤中的作用機制研究，可對該基因多態(tài)性病因?qū)W更好地做出闡述[22]。由于TTR存在部分突變體，當這些突變體發(fā)生變化時將可能對診斷的準確性造成一定的影響，造成結(jié)果不準確，這也是需要進一步探討的問題。當前測定總體TTR含量可采用電流測定，同時酶聯(lián)免疫法測定TTR技術也逐漸得到應用推廣，測定技術變得更加成熟，而測定結(jié)果也更加穩(wěn)定，特異性也顯著提高，因此進一步開展對TTR表達的研究可使臨床腫瘤測定結(jié)果穩(wěn)定性和特異性也進一步提高，相信深入開展TTR 對于臨床腫瘤的診斷具有非常重要的意義和發(fā)展前景。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者血清TTR的表達水平與腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有相關性，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者血清TTR表達量顯著更低，在今后對結(jié)直腸癌浸潤與轉(zhuǎn)移水平的評估中，TTR可作為一種腫瘤標志物。

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（收稿日期：2016-06-24）