于瑞嵩，董世娟，司伏生，蔣鳳英，謝春芳，陳冰清，喻利，李震

1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106

2 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106

豬流行性腹瀉病毒反向遺傳操作技術(shù)及其應(yīng)用

于瑞嵩1,2，董世娟1,2，司伏生1，蔣鳳英1,2，謝春芳1,2，陳冰清1，喻利1，李震1,2

1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106

2 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106

于瑞嵩, 董世娟, 司伏生, 等. 豬流行性腹瀉病毒反向遺傳操作技術(shù)及其應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(2): 205–216.

Yu RS, Dong SJ, Si FS, et al. Advances in reverse genetics to treat porcine epidemic diarrhea virus. Chin J Biotech, 2017, 33(2): 205–216.

豬流行性腹瀉病毒 (PEDV) 是引起豬 (特別是新生仔豬) 急性、高度傳染性消化道疾病的主要病原之一；2010年底以來，豬流行性腹瀉 (PED) 的再次暴發(fā)給我國(guó)乃至全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。最近，研究者已先后建立了基于靶向RNA重組技術(shù)、細(xì)菌人工染色體 (BAC) 載體系統(tǒng)和體外連接技術(shù)的PEDV反向遺傳學(xué)操作技術(shù)，為PEDV編碼的蛋白質(zhì)的功能、致病機(jī)制以及新型疫苗的研發(fā)開辟了新的思路。本文對(duì)PEDV反向遺傳操作技術(shù)的研究進(jìn)展及其在PEDV胰酶依賴性、S蛋白和ORF3蛋白的功能以及新一代疫苗研制等方面的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述與展望。

豬流行性腹瀉病毒，反向遺傳學(xué)，胰酶，S蛋白，ORF3蛋白，細(xì)胞適應(yīng)性，疫苗

豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) 與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)同屬于尼多病毒目、冠狀病毒科的α冠狀病毒屬，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒[1]。PEDV引起豬特別是初生仔豬的嘔吐、腹瀉和食欲下降；嚴(yán)重時(shí)死亡率可以達(dá)到100%。雖然豬流行性腹瀉 (Porcine epidemic diarrhea，PED) 首次發(fā)現(xiàn)于歐洲，并隨后證實(shí)PEDV是導(dǎo)致豬流行性腹瀉的病原，但20世紀(jì)80年代以后PED主要在亞洲國(guó)家流行，幾十年來一直困擾著亞洲養(yǎng)豬業(yè)[1]。2010年12月以來，PED再次在我國(guó)全國(guó)范圍內(nèi)呈暴發(fā)式流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。2013年3月以后，PED首次在美國(guó)報(bào)道，并迅速蔓延至其他美洲、歐洲國(guó)家[3]；亞洲其他國(guó)家或地區(qū)也相繼報(bào)道PED疫情的暴發(fā)。目前，PED已蔓延至全球，給全世界養(yǎng)豬業(yè)的疾病防控帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

PEDV基因組全長(zhǎng)約28 kb，除了5′和3′端非編碼區(qū)外還包括7個(gè)開放閱讀框 (ORF，圖1)。PEDV基因組5′端的2/3編碼在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用的多聚體蛋白ORF1a和ORF1ab；而3′端編碼纖突蛋白 (S)、囊膜蛋白 (E)、膜蛋白 (M)、核衣殼蛋白 (N)和一個(gè)輔助蛋白ORF3。S蛋白在病毒與受體結(jié)合、膜融合、病毒侵入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用；S蛋白也包含主要的誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的抗原表位。E蛋白在病毒的組裝和出芽過程中發(fā)揮作用。M蛋白在病毒的組裝過程中發(fā)揮作用，也可以誘導(dǎo)感染宿主產(chǎn)生中和抗體。N蛋白與病毒RNA結(jié)合，為病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和組裝提供骨架。ORF3蛋白可能與PEDV的細(xì)胞適應(yīng)性和毒力有關(guān)[4]。

圖1 PEDV基因組及其開放閱讀框Fig. 1 PEDV genome and its open reading frames.

由于長(zhǎng)期缺乏有效的PEDV遺傳操作系統(tǒng)，且臨床分離毒株的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)常遇到困難，因此對(duì)PEDV的侵入機(jī)制、發(fā)病機(jī)理和免疫機(jī)制仍缺乏深入的研究。作為冠狀病毒家族的成員，PEDV 約28 kb的基因組增加了其反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)建立的難度，需要一個(gè)高容量的載體克隆PEDV的全長(zhǎng)cDNA片段；而且PEDV含有的毒性序列會(huì)導(dǎo)致病毒基因組cDNA在高拷貝質(zhì)粒中的不穩(wěn)定；長(zhǎng)基因組感染性克隆建立的另一個(gè)挑戰(zhàn)是很難將病毒復(fù)制自然產(chǎn)生的突變與基因擴(kuò)增和測(cè)序產(chǎn)生的突變區(qū)分開來。最近，借鑒其他冠狀病毒反向遺傳學(xué)操作技術(shù)，研究者建立了3種PEDV的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，這3種操作系統(tǒng)分別基于靶向RNA同源重組技術(shù)、細(xì)菌人工染色體 (Bacterial artificial chromosome，BAC) 載體系統(tǒng)和體外連接技術(shù)。這些反向遺傳操作技術(shù)的建立 (盡管存在各自的優(yōu)點(diǎn)和不足)，推動(dòng)了PEDV復(fù)制和致病性研究的不斷深入。

1 PEDV的反向遺傳學(xué)技術(shù)

1.1 靶向RNA同源重組技術(shù)

靶向RNA同源重組技術(shù)是最早建立的冠狀病毒反向遺傳學(xué)操作技術(shù)。該技術(shù)最早用于獲得重組鼠肝炎病毒 (MHV) 并得到進(jìn)一步完善[5]。利用冠狀病毒感染宿主過程中RNA的高重組率和S蛋白決定冠狀病毒的嚴(yán)格細(xì)胞嗜性的特性，通過替換s基因來改變重組病毒細(xì)胞嗜性，從而簡(jiǎn)化了篩選重組體病毒過程[5]。目前，該技術(shù)被應(yīng)用到其他冠狀病毒的反向遺傳學(xué)操作，如貓傳染性腹膜炎病毒 (FIPV)[6]和PEDV[7]。

通過與荷蘭烏特勒支大學(xué)合作，本實(shí)驗(yàn)室首先建立了基于靶向RNA重組技術(shù)的PEDV反向遺傳學(xué)操作技術(shù)[7]。重組PEDV的獲得包括兩步：構(gòu)建嚴(yán)格鼠源細(xì)胞嗜性的攜帶MHVs基因(S蛋白胞外區(qū)編碼序列) 的嵌合體PEDV (mPEDV) 和拯救嚴(yán)格Vero細(xì)胞嗜性的目標(biāo)重組PEDV。首先構(gòu)建重組供體質(zhì)粒，依次包含噬菌體T7 RNA聚合酶 (體外RNA轉(zhuǎn)錄) 編碼序列、orf1a/1b部分片段 (同源重組的同源臂)、MHV S蛋白胞外區(qū)編碼序列(替換PEDVs基因相應(yīng)序列) 以及包括orf3、e、m和n基因的PEDV基因組下游序列。將供體質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA轉(zhuǎn)染PEDV感染的Vero細(xì)胞，以鼠源LR7細(xì)胞篩選嵌合體病毒mPEDV。第2步，構(gòu)建包含相同基因組區(qū)域、攜帶PEDVs基因的第2個(gè)重組供體質(zhì)粒。同時(shí)，在質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)可以依研究目的改變s和/或其他基因 (orf3、e、m、n)的序列或順序，甚至刪除orf3基因或以報(bào)告基因如熒光素酶基因替代orf3。隨后，將體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA轉(zhuǎn)染mPEDV感染的LR7細(xì)胞，然后在Vero細(xì)胞上拯救目標(biāo)重組PEDV (圖2)。

盡管靶向RNA同源重組技術(shù)在冠狀病毒反向遺傳學(xué)發(fā)展的進(jìn)程中扮演著重要角色，但是該技術(shù)不能對(duì)基因組5′-端包含復(fù)制酶的2/3區(qū)域進(jìn)行操作。另外，由于利用T7 RNA聚合酶獲得供體RNA，需要仔細(xì)分析病毒的基因序列以防止出現(xiàn)隱含的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。而且，需要對(duì)拯救得到的重組病毒進(jìn)行噬斑純化，操作程序相對(duì)繁瑣。因此，雖然靶向RNA同源重組技術(shù)是全長(zhǎng)感染性克隆構(gòu)建成功之前值得嘗試的冠狀病毒反向遺傳學(xué)操作技術(shù)，研究者一直沒有放棄對(duì)構(gòu)建全長(zhǎng)PEDV cDNA感染性克隆的探索。

圖2 利用靶向RNA同源重組技術(shù)構(gòu)建重組PEDV (根據(jù)Li等[7]修改)Fig. 2 Targeted RNA recombination scheme to make recombinant PEDV (Adapted from Li et al[7]).

1.2 基于BAC載體的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)

BAC可以容納大片段外源DNA插入 (300 kb)和低拷貝 (1–2個(gè)拷貝) 的特性解決了冠狀病毒基因組中含有的毒性序列導(dǎo)致的cDNA在高拷貝質(zhì)粒中的不穩(wěn)定問題。利用BAC系統(tǒng)，已先后獲得了TGEV、SARS-CoV、HCoV-OC43、FIPV、MERS-CoV和MHV的感染性克隆[8-10]。最近，泰國(guó)學(xué)者利用BAC載體系統(tǒng)獲得了PEDV的感染性克隆[11]。

首先，他們根據(jù)PEDV AVCT12株基因組限制酶切位點(diǎn)的分布將其分為8個(gè)片段，每個(gè)片段的兩端均帶有合適的 (本來或引入的) 限制性酶切位點(diǎn)[11]；片段兩兩連接直到合成全長(zhǎng)的cDNA。全長(zhǎng)感染性克隆表達(dá)框依次包括：巨細(xì)胞病毒 (CMV) 啟動(dòng)子、PEDV基因組全長(zhǎng)序列(包括5′-UTR和3′-UTR)、25個(gè)堿基的ploy(A)、δ肝炎病毒 (HDV) 核糖體自切割序列和牛生長(zhǎng)激素 (BDH) 終止和ploy (A) 序列。在表達(dá)框的兩端各包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列 (T) 以減少從隱性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄和對(duì)細(xì)菌的毒性，從而提高病毒cDNA在BAC載體中的穩(wěn)定性 (圖3)。然后，將攜帶PEDV cDNA的BAC載體轉(zhuǎn)染Vero-E6-APN細(xì)胞系來拯救和增殖病毒。拯救得到的病毒表現(xiàn)出與親本毒株相似的生長(zhǎng)特性，表明限制性酶切位點(diǎn)序列的引入并沒有影響PEDV在細(xì)胞上的復(fù)制。

利用BAC載體構(gòu)建PEDV感染性克隆有效克服了冠狀病毒含有的毒性序列在高拷貝質(zhì)粒中的不穩(wěn)定難題，理論上可以對(duì)整個(gè)基因組中的每個(gè)基因進(jìn)行遺傳操作；而且具有較高的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率，病毒基因組RNA能夠在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中迅速復(fù)制。但是，由于需要?jiǎng)h除和/或向病毒cDNA中引入新的限制性酶切位點(diǎn)序列，在選擇限制性酶時(shí)需精心設(shè)計(jì)，避免引入的突變影響到病毒的復(fù)制而導(dǎo)致拯救病毒失敗。另外，他們還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子序列插入到感染性克隆的PEDV cDNA序列中而影響了病毒的拯救[11]。雖然通過選擇E. coliDH10B增殖克隆和亞克隆載體和測(cè)序驗(yàn)證所有克隆避免了轉(zhuǎn)座子插入的問題，構(gòu)建感染性克隆的每一步都必須驗(yàn)證cDNA的序列是該技術(shù)克隆成功的關(guān)鍵點(diǎn)。

圖3 利用BAC系統(tǒng)構(gòu)建PEDV感染性克隆 (根據(jù)Jengarn等[11]修改)Fig. 3 BAC system scheme to make infectious clone of PEDV (Adapted from Jengarn et al[11]).

1.3 基于體外連接的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)

完全避免在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增病毒cDNA是避免病毒cDNA在細(xì)菌中的不穩(wěn)定性和毒性的最有效措施。基于體外連接的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)就是在體外將病毒cDNA片段連接成全長(zhǎng)的cDNA，然后利用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄獲得感染性病毒基因組RNA，隨后將基因組RNA電轉(zhuǎn)至合適的細(xì)胞來拯救 (重組) 病毒。Yount等首先利用這種體外組裝大片段DNA的技術(shù)獲得了TGEV感染性克隆[12]，隨后該技術(shù)擴(kuò)展到其他冠狀病毒，如MHV、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、SARS-CoV、HKU3、HCoV-NL63和MERS-CoV的反向遺傳學(xué)操作中[13-14]。

最近，Beall等采用體外連接技術(shù)獲得了PEDV北美強(qiáng)毒株P(guān)C22A的感染性cDNA克隆[15]。他們首先擴(kuò)增得到6個(gè)PEDV cDNA片段并分別插入到亞克隆載體中，每一片段的兩側(cè)分別添加特定的Ⅱ型限制性酶切位點(diǎn) (用于產(chǎn)生無縫連接的粘性末端)。另外，第一個(gè)cDNA片段的5′-端帶有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，最后一個(gè)cDNA片段的3′-端帶有25個(gè)堿基的poly(A)序列以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄和RNA加帽。這些片段隨后經(jīng)酶切、連接和體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒的全長(zhǎng)RNA (圖4)。最后，將RNA與n基因的轉(zhuǎn)錄物共電轉(zhuǎn)至Vero細(xì)胞中拯救得到感染性的(重組) PEDV。

體外連接技術(shù)不僅具有BAC系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)，如可以操作整個(gè)PEDV的基因組、避免了冠狀病毒毒性基因在細(xì)菌中的不穩(wěn)定性等。這種體外連接組裝大片段DNA的方法也可以替代BAC和靶向RNA重組系統(tǒng)中的DNA片段的連接方法，從而省去繁瑣的限制性內(nèi)切酶的選擇和設(shè)計(jì)過程。而且，它不需要一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)菌載體(如BAC) 來克隆全長(zhǎng)的cDNA，分離的cDNA片段各自保存在亞克隆載體中。通過體外連接cDNA片段獲得感染性克隆的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是只需對(duì)發(fā)生變異的cDNA片段進(jìn)行操作就能夠在最短的時(shí)間內(nèi)獲得新發(fā)病毒的感染性克隆，不需要將所有片段連接載體來構(gòu)建全長(zhǎng)感染性克隆，可以及時(shí)應(yīng)對(duì)具有高變異特性的冠狀病毒如PEDV的新疫情。由于需要體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒基因組RNA，這項(xiàng)技術(shù)也放大了靶向RNA重組方法的某些缺點(diǎn)。如全長(zhǎng)RNA的正確性取決于T7 RNA聚合酶的保證度，可能每次試驗(yàn)都會(huì)不同，且不能事先確證。而且，雖然已有研究證明將復(fù)制酶基因在特定的區(qū)域分成分離的片段可以幫助減輕復(fù)制酶的毒性問題，但是即使將復(fù)制酶片段插入到亞克隆載體中仍然存在復(fù)制酶片段的毒性問題[13]。

圖4 利用體外連接法構(gòu)建PEDV感染性克隆 (根據(jù)Beall等[15]修改)Fig. 4 In vitroligation scheme to make infectious clone of PEDV (Adapted from Beall et al[15]).

1.4 其他值得嘗試的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)

1.4.1 利用痘病毒載體的反向遺傳學(xué)技術(shù)

痘病毒基因組中存在大量的非必需區(qū)，可允許大片段外源基因的插入，且外源基因的插入不影響病毒的復(fù)制；痘病毒很容易培養(yǎng)到高滴度，可以有效地感染包括原代細(xì)胞、哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系；因此痘病毒載體是構(gòu)建包括PEDV在內(nèi)的冠狀病毒感染性克隆的理想載體。目前，痘病毒載體已經(jīng)被用于IBV、MHV、FCoV和SARS-CoV的反向遺傳學(xué)操作[16-17]。雖然，還沒有將痘病毒載體用于PEDV反向遺傳學(xué)的報(bào)道，它具有的優(yōu)勢(shì)值得嘗試。

1.4.2 利用Gibson組裝系統(tǒng)的反向遺傳學(xué)技術(shù)

Gibson組裝系統(tǒng)是2009年由Gibson等發(fā)明的一種可以將DNA片段連接成幾十Mb長(zhǎng)片段的新方法[18]。設(shè)計(jì)相鄰DNA片段3′-和5′-端包含20–40 bp相互重疊序列，通過3個(gè)關(guān)鍵的成分，即5′-外切酶 (產(chǎn)生粘性末端)、DNA聚合酶 (補(bǔ)平粘性末端退火后留下的缺口)、DNA連接酶，將多個(gè)DNA片段一步等溫反應(yīng)連接起來。雖然Gibson組裝系統(tǒng)尚未用于冠狀病毒感染性克隆的構(gòu)建，這種方法已經(jīng)被成功用于同為尼多病毒目的豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)感染性克隆的構(gòu)建[19]。由于不需要限制性酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，這種方法也可以作為體外連接法的有益補(bǔ)充，或用于將cDNA克隆至BAC或痘病毒載體。

2 反向遺傳學(xué)技術(shù)在PEDV研究中的應(yīng)用

2.1 胰酶與PEDV體外增殖

冠狀病毒的S蛋白決定其嚴(yán)格的宿主細(xì)胞嗜性，作為Ⅰ型融合蛋白，S通過與宿主細(xì)胞上特定受體結(jié)合及其膜融合活性發(fā)揮功能。Ⅰ型融合蛋白通常以前體蛋白形式表達(dá)出來，隨后被蛋白酶裂解為2個(gè)亞基 (S1和S2) 而釋放出活化的融合肽。然而，冠狀病毒融合肽的活化似乎還需要S2中的第二個(gè)裂解位點(diǎn) (S2′) 的裂解[20-21]。根據(jù)與其他冠狀病毒S蛋白的同源比對(duì)，PEDV的S蛋白也可以分為2個(gè)亞基 (S1和S2)；然而，與TGEV相似，在預(yù)測(cè)的PEDV S1和S2交界處并不存在β和γ冠狀病毒S蛋白含有的弗林蛋白酶 (Furin) 識(shí)別序列[22]。根據(jù)PEDV的腸道嗜性 (富含胰酶)，很可能在體內(nèi)這種低特異性的胰酶介導(dǎo)了PEDV S蛋白的裂解活化。因此，PEDV的細(xì)胞傳代和增殖需要胰酶的存在；這個(gè)Vero細(xì)胞-胰酶系統(tǒng)現(xiàn)在已經(jīng)成為PEDV體外培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)體系。PEDV在表達(dá)跨膜Ⅱ型絲氨酸蛋白酶2的Vero細(xì)胞上增殖顯示胰酶的功能可以被其他蛋白酶替代[23]。

目前，已有利用反向遺傳學(xué)工具來嘗試回答關(guān)于PEDV胰酶依賴性問題的報(bào)道。Wicht等利用靶向RNA重組技術(shù)，構(gòu)建攜帶來源于胰酶依賴毒株CV777的s基因 (sCV777) 或胰酶不依賴毒株DR13的s基因 (sDR13) 的重組PEDV，驗(yàn)證了胰酶對(duì)病毒侵入的影響[24]。受體結(jié)合后以胰酶處理可以顯著提高攜帶sCV777重組病毒的相對(duì)感染率，而降低攜帶sDR13重組病毒的相對(duì)感染率[24]，表明與SARS-CoV相似，PEDV S蛋白被胰酶的裂解可能發(fā)生在受體結(jié)合后，受體結(jié)合誘導(dǎo)的構(gòu)象變化增加了S蛋白的可及性[25]。隨后，他們通過構(gòu)建系列攜帶嵌合體s基因的重組PEDV，將胰酶的依賴性定位到S2亞基中包含融合肽和第1個(gè)七肽重復(fù)序列的區(qū)域[24]。他們推測(cè)位于融合肽上游S2′位點(diǎn)的精氨酸殘基R890(精氨酸或賴氨酸是胰酶的靶點(diǎn)，在細(xì)胞適應(yīng)株DR13 S中突變?yōu)楦拾彼?，可能是胰酶依賴性的關(guān)鍵位點(diǎn)。當(dāng)把這個(gè)區(qū)域突變?yōu)閒urin裂解識(shí)別基序后，重組PEDV在Vero細(xì)胞的增殖不再依賴于胰酶 (雖然滴度較低)，證實(shí)了S2′裂解位點(diǎn)可能是PEDV胰酶依賴性關(guān)鍵位點(diǎn)[26]。

2.2 PEDV S蛋白突變體

根據(jù)PEDVs基因遺傳進(jìn)化分析可以把PEDV流行株分為兩組[1]。第1組為PEDV優(yōu)勢(shì)流行毒株，與CV777相比，它們的S蛋白在55和135位分別插入4個(gè)氨基酸和1氨基酸，在160位缺失2個(gè)氨基酸。第2組中PEDV的S蛋白失去了第1組中S蛋白的插入和缺失變異，其s1基因序列反而與CV777等早期分離株和疫苗株的同源性更高[1]。而且第2組的某些毒株的毒力與第1組中流行毒株的毒力相比出現(xiàn)了不同程度的減弱[27-30]。由于基因組背景、細(xì)胞適應(yīng)性、攻毒劑量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特征的不同，很難對(duì)此進(jìn)行比較和解釋，以確定導(dǎo)致這些毒株毒力改變的關(guān)鍵變異。利用反向遺傳學(xué)技術(shù)來拯救包含這些變異位點(diǎn)的重組病毒，將能夠在更一致的條件下分析這些變異對(duì)PEDV毒力的影響。

除了上述特異位點(diǎn)的插入或缺失外，s基因的大片段缺失也見于多個(gè)PEDV分離株中[31-33]。這些缺失可以在S1亞基的C-端[31,33]或N-端編碼區(qū)[32]，可以是自然突變產(chǎn)生或細(xì)胞適應(yīng)過程中產(chǎn)生；這些毒株的細(xì)胞適應(yīng)性也各不相同。s基因的這種大片段的缺失在其他冠狀病毒中也有發(fā)現(xiàn)，TGEV S1 N端224個(gè)氨基酸的缺失產(chǎn)生了抗原性不同的感染豬呼吸道的豬呼吸道冠狀病毒。缺失的區(qū)域編碼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此被認(rèn)為引起了TGEV腸道嗜性的喪失[34]。與貓腸道冠狀病毒 (FECV) 具有完整的s基因不同，大約20% FIPVs基因含有大片段缺失 (未發(fā)表數(shù)據(jù))。這很容易使人推測(cè)s基因的大片段缺失可能改變了受體或多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而影響受體結(jié)合和使用的效率或選擇性。反向遺傳學(xué)技術(shù)將有助于闡明這些編碼區(qū)域與病毒入侵、嗜性和致病性的關(guān)系。

Shirato等[35]發(fā)現(xiàn)，PEDV S蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間體定位信號(hào)基序 (K-x-H-x-x，x為任意氨基酸殘基) 中的1381H→R突變不僅可以提高S蛋白的融合活性，而且增加了其對(duì)小鼠的毒性。但這是不是PEDV及其他冠狀病毒的一個(gè)普遍特性？這些問題的闡明也需要利用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救包含這些突變的系列重組PEDV并對(duì)它們的特性進(jìn)行分析。

2.3 ORF3蛋白功能和細(xì)胞適應(yīng)性

ORF3蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的PEDV的唯一輔助性蛋白。PEDV強(qiáng)、弱毒株的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)弱毒/疫苗株的orf3基因存在不同程度堿基的缺失，從而導(dǎo)致其編碼氨基酸殘基的缺失或翻譯的提前終止[36-37]。因此，ORF3蛋白截短被認(rèn)為影響PEDV的致病性。然而，并不是所有的ORF3蛋白截短都可以與致病性減弱關(guān)聯(lián)起來。最近，分離自我國(guó)福建地區(qū)某豬場(chǎng)臨床樣品的PEDV編碼截短ORF3蛋白，但它的毒力與具有全長(zhǎng)orf3基因的分離株相比并沒有不同[38]。在另一項(xiàng)對(duì)PEDV YN1分離株細(xì)胞傳代的研究中發(fā)現(xiàn)第15代病毒YN15的orf3基因有8個(gè)氨基酸編碼序列發(fā)生突變并導(dǎo)致了翻譯的提前終止，然而其對(duì)仔豬的致病性與YN1相似，YN1的子代病毒獲得截短的ORF3蛋白似乎對(duì)其適應(yīng)細(xì)胞更為重要[39]。

細(xì)胞適應(yīng)株P(guān)EDV具有截短的ORF3蛋白暗示它在細(xì)胞培養(yǎng)上的非必要性。這已經(jīng)得到反向遺傳學(xué)方法的證實(shí)，Li等和Jengarn等相繼利用反向遺傳學(xué)技術(shù)成功拯救了缺失orf3基因的重組PEDV[7,11]。然而，Jengarn等嘗試拯救恢復(fù)orf3基因的重組病毒并沒有成功，并認(rèn)為orf3基因可能對(duì)病毒在細(xì)胞上的生長(zhǎng)產(chǎn)生有害的影響[11]。而在另一項(xiàng)研究中，帶有完整orf3基因的PEDV強(qiáng)毒株P(guān)C22A感染性克隆能夠拯救成功[15]。而且，orf3基因的刪除并沒有顯著影響重組病毒在仔豬上的致病性，所有接種的仔豬都死于疾病，或在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)由于疾病而不得不被安樂死[15]。我們最近也拯救到了攜帶完整orf3基因的重組PEDV Dr13株 (結(jié)果未發(fā)表)。

關(guān)于ORF3蛋白的作用和在體內(nèi)外對(duì)病毒復(fù)制和致病性的重要性，目前研究結(jié)果仍存在爭(zhēng)議。ORF3蛋白的功能和重要性可能依病毒和宿主細(xì)胞背景的不同而不同。應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)將有助于控制每項(xiàng)研究的不同，也可以使分析其他病毒蛋白在介導(dǎo)PEDV細(xì)胞適應(yīng)和致病性的影響與ORF3蛋白的影響結(jié)合起來成為可能。

2.4 研制新型PED疫苗

目前的PED疫苗大部分 (如果不是全部)都是為母體免疫設(shè)計(jì)的，這是因?yàn)樾律胸i通常不能及時(shí)產(chǎn)生足夠的初次免疫應(yīng)答以防止疾病的發(fā)生，特別是對(duì)于那些與烈性病毒感染相關(guān)的疾病。它們依賴于從初乳和乳汁中獲得的母源被動(dòng)免疫[40]。PEDV主要通過直接侵入小腸絨毛壁上皮細(xì)胞感染其宿主，且病毒不需要系統(tǒng)性的傳播，因此黏膜免疫，特別是分泌性IgA，參與病毒的中和作用和免疫保護(hù)[40]。雖然PEDV特異性的IgG在母豬的初乳中大量存在，但其在產(chǎn)后母豬的乳汁中迅速下降，因此保護(hù)時(shí)間非常短[41]。越來越多的證據(jù)表明，以活的PEDV口服免疫懷孕母豬是刺激母豬產(chǎn)生充足的乳源免疫來保護(hù)仔豬所必需的[41-43]。

PED口服疫苗的效力很大程度上取決于其在豬腸上皮細(xì)胞上的感染和增殖能力。然而PEDV對(duì)Vero細(xì)胞培養(yǎng)的適應(yīng)似乎影響到它作為口服疫苗的病毒效力。與在Vero細(xì)胞傳代75或90代的細(xì)胞適應(yīng)毒株相比，PEDV Dr13親本株經(jīng)口服接種母豬可誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)[44]。Chen等最近通過以低 (YN15) 或高 (YN144)傳代次數(shù)PEDV口服接種哺乳仔豬的毒力實(shí)驗(yàn)也證實(shí)YN144幾乎沒有感染仔豬的小腸上皮細(xì)胞[39]。其他實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果也顯示Vero細(xì)胞適應(yīng)的PEDV毒株在豬小腸上皮細(xì)胞上感染和復(fù)制效率比在Vero細(xì)胞上的效率要差[45]。

為了開發(fā)有效的PED疫苗，接種的疫苗不僅要保持在體外的高生長(zhǎng)特性，而且在保證毒力減弱的同時(shí)必須盡量保持病毒對(duì)小腸細(xì)胞的適應(yīng)性。PEDV反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)的快速發(fā)展給新型疫苗的研發(fā)提供了巨大的潛力。隨著對(duì)臨床分離株和細(xì)胞適應(yīng)株差異了解的不斷深入，將可能利用反向遺傳學(xué)技術(shù)來改造具有高生長(zhǎng)滴度的PEDV毒株，將其細(xì)胞嗜性從猴源的Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)換為豬源細(xì)胞。對(duì)重組病毒侵入Vero細(xì)胞和豬小腸上皮細(xì)胞的機(jī)制研究的不斷深入將揭示涉及細(xì)胞適應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸殘基，這將為利用反向遺傳學(xué)技術(shù)改造Vero細(xì)胞適應(yīng)PEDV以增加其小腸細(xì)胞嗜性提供關(guān)鍵信息。通過利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建攜帶嵌合體或突變體s基因的重組PEDV可以在核苷酸水平上證實(shí)決定病毒嗜性的堿基序列，從而為獲得帶有小腸上皮細(xì)胞入侵必需結(jié)構(gòu)域、同時(shí)保持誘導(dǎo)保護(hù)性體液免疫所必需抗原位點(diǎn)的新型、高效重組PED疫苗鋪平道路。

3 小結(jié)與展望

2010年底以來，全球范圍內(nèi)的PED爆發(fā)使PEDV再次成為研究熱點(diǎn)。PEDV反向遺傳學(xué)技術(shù)為研究病毒蛋白質(zhì)的功能、揭示病毒復(fù)制及其致病機(jī)制開辟了新的途徑。然而，反向遺傳學(xué)技術(shù)最具潛力的應(yīng)用在于研發(fā)新型疫苗，可以通過突變或刪除毒力相關(guān)基因并同時(shí)引入分子標(biāo)記在短時(shí)間內(nèi)迅速研制出標(biāo)記疫苗，通過與之相配套的檢測(cè)方法，將野毒感染和疫苗免疫區(qū)分開來；及時(shí)應(yīng)對(duì)爆發(fā)的PED新疫情。雖然近年來分子病毒學(xué)發(fā)展迅速，但是對(duì)PEDV的研究才剛剛起步。與MHV、SARS-CoV等相比，PEDV結(jié)構(gòu)蛋白的研究還較少；復(fù)制酶復(fù)合體蛋白ORF1a和ORF1ab裂解形成的15個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白的功能還不清楚；ORF3蛋白雖然不是PEDV復(fù)制所必需的，但是對(duì)于其具體功能仍存在爭(zhēng)議。

因此，未來PEDV的研究重點(diǎn)可能主要會(huì)集中在以下幾個(gè)方面：PEDV免疫逃逸的分子機(jī)制研究-闡明哪些蛋白質(zhì)參與了宿主天然免疫的抑制及其信號(hào)通路；PEDV自身編碼蛋白間的相互作用及其對(duì)病毒自身復(fù)制的調(diào)控；PEDV粘膜免疫機(jī)制研究-探索PEDV如何誘發(fā)腸道-乳腺-sIgA軸的反應(yīng)模式。反向遺傳學(xué)技術(shù)作為這些研究中的一種必不可少的工具，必定會(huì)發(fā)揮出巨大的作用。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Advances in reverse genetics to treat porcine epidemic diarrhea virus

Ruisong Yu1,2, Shijuan Dong1,2, Fusheng Si1, Fengying Jiang1,2, Chunfang Xie1,2, Bingqing Chen1, Li Yu1, and Zhen Li1,2
1Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai201106,China
2Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding,Shanghai201106,China

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is one of the major etiologies responsible for the acute, highlycontagious disease in the digestive tract of pigs, especially neonatal piglets. Since PEDV was first identified in Europe in the late 1970s, it has resulted in significant economic losses in many Asian swine-raising countries, including China. Recently, reverse genetics techniques including targeted RNA recombination, bacteria artificial chromosome system andin vitroligation have been successfully used to manipulate the genome of PEDV, which providing new strategies for the clear delineation of the functions of the viral proteins, the mechanisms behind PEDV pathogenesis and the design of novel vaccines against PEDV. Here, we review the progresses of different reverse genetics platforms developed for PEDV and their applications, covering the roles of trypsin in PEDV propagation, functions of S and ORF3 protein and the development of next generation PED vaccines, and the perspectives of reverse genetics for PEDV.

porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), reverse genetics, trypsin, S protein, ORF3 protein, cell adaption, vaccine

Zhen Li. Tel: +86-21-62206391; Fax: +86-21-62207858; E-mail: zhenli60@163.com

Received:June 26, 2016;Accepted: September 30, 2016

Supported by:Shanghai Key Technology R&D Program (No. 13391901502), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31402219, 315725199), Shanghai Key Project on Agricultural Development (No. 2015-6-1-9)

上海市科技支撐項(xiàng)目 (No. 13391901502)，國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31402219, 315725199)，上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目 (滬農(nóng)科攻字 (2015) 第6-1-9號(hào)) 資助。

時(shí)間：2016-10-24

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20161024.1103.003.html