董悅，胡坤樂，李興林，李清艷，張學禮

1 天津科技大學 生物工程學院，天津 300457

2 中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308

3 河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023

代謝工程改造甘油代謝途徑提高β-胡蘿卜素產量

董悅1,2*，胡坤樂3*，李興林1，李清艷2，張學禮2

1 天津科技大學 生物工程學院，天津 300457

2 中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308

3 河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023

董悅, 胡坤樂, 李興林, 等. 代謝工程改造甘油代謝途徑提高β-胡蘿卜素產量. 生物工程學報, 2017, 33(2): 247–260.

Dong Y, Hu KL, Li XL, et al. Improving β-carotene production inEscherichia coliby metabolic engineering of glycerol utilization pathway. Chin J Biotech, 2017, 33(2): 247–260.

甘油是生物柴油的副產物，因其價格低廉和高還原性，成為生物發(fā)酵的重要碳源。為了進一步提高工程菌對甘油的利用能力，從而提高萜類化合物的合成能力，本研究從β-胡蘿卜素高產菌CAR015出發(fā)，對其甘油代謝途徑的多個基因進行了調控。首先敲除了編碼3-磷酸甘油抑制子的glpR基因，然后分別用M1-37、M1-46和M1-93三個不同強度的人工調控元件對glpFK、glpD和tpiA三組基因進行單基因調控和多基因組合調控。研究發(fā)現(xiàn)用M1-46調控glpD基因后β-胡蘿卜素產量達到了64.82 mg/L，是CAR015的4.86倍，甘油消耗速率也提高了100%；調控tpiA基因后β-胡蘿卜素產量略有提高；調控glpFK基因后β-胡蘿卜素產量略有降低。說明GlpD是甘油代謝途徑中的關鍵限速步驟。Q-PCR結果表明，降低甘油代謝途徑的glpD和glpFK基因轉錄水平，增加tpiA基因轉錄水平，可以增加細胞生長速度、提高β-胡蘿卜素產量，可能是因為減少了丙酮醛毒性所致。組合調控glpD和tpiA基因，獲得β-胡蘿卜素產量最高菌株Gly003，其β-胡蘿卜素產量達72.45 mg/L、產率達18.65 mg/g每克干細胞，分別是出發(fā)菌株CAR015的5.23倍和1.99倍。總之，GlpD是甘油代謝途徑中的關鍵限速步驟，適當強度調控glpD，可以有效提高重組大腸桿菌的β-胡蘿卜素產量。

β-胡蘿卜素，萜類化合物，甘油代謝，大腸桿菌

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素家族中的典型代表，也是生物體內合成維生素A的前體物質，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，廣泛應用于化工、化妝品、飼料、食品、保健品以及醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]。目前市場上銷售的β-胡蘿卜素有化學合成和天然提取，化學合成法合成的產品存在有害物質殘留問題，與化學合成的產品相比，天然β-胡蘿卜素具有更好的生物活性且無毒副作用，隨著人們生活品質的不斷提高以及對綠色天然產品的倡導，天然β-胡蘿卜素的市場需求將會越來越大[3]。微生物發(fā)酵生產天然β-胡蘿卜素不受光照、氣候、產地等條件的限制，且產品具有經(jīng)濟、安全等優(yōu)勢，因此該技術受到國內外市場的廣泛青睞[4-5]。以大腸桿菌作為出發(fā)菌株，運用代謝工程手段構建產類胡蘿卜素基因工程高產菌株，成為包括β-胡蘿卜素在內的多種類胡蘿卜素產品生產開發(fā)的新模式[4-7]。

對產β-胡蘿卜素大腸桿菌的遺傳改造主要集中在過表達大腸桿菌自身的2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑 (MEP途徑) 中的關鍵基因和過表達外源的甲羥戊酸途徑 (MVA途徑)[4-5]。另外，近年來部分研究組通過代謝流分析等，研究了非代謝途徑基因表達水平對萜類化合物產量的影響。Alper利用代謝流分析，驗證了敲除gdhA、aceE、talB、gdhA、aceE和fdhF基因對番茄紅素產量的影響，發(fā)現(xiàn)同時敲除gdhA、aceE和fdhF，產量提高37%[8]。Farmer等通過高表達pps，平衡PEP和P3G供應提高番茄紅素產量[9]。Choi等發(fā)現(xiàn)高表達pfkA、pgi、fbaA、tpiA、icdA和mdh可以提高番茄紅素產量，fbaA、tpiA和mdh效果最明顯。gdhA和gpmB雙敲除效果最好，同時高表達mdh和pps，番茄紅素產量達到283 mg/L[10]。Zhao等系統(tǒng)研究了中央代謝途徑和ATP合成途徑各基因的轉錄水平對β-胡蘿卜素產量的影響，發(fā)現(xiàn)高表達sucAB、sdhAB和talB基因可以有效提高β-胡蘿卜素產量，產量比出發(fā)菌株高64%[11]。因此改造大腸桿菌內非MEP途徑基因表達水平成為提高萜烯類化合物合成的重要手段。

甘油是脂肪酸工業(yè)和生物柴油制造工業(yè)不可避免的副產物，曾是我國比較緊缺的化工產品。近年來，隨著國內外對生物柴油制造進行的研究和應用，作為生物柴油的副產物，甘油產量大大增加，價格也大幅度下降[12]。因此，利用甘油作為發(fā)酵原料制造大宗化學品具有豐富、廉價的優(yōu)勢，同時還可降低生物柴油制造業(yè)處理副產廢物的壓力[13]。此外，與葡萄糖、木糖等糖類底物相比，甘油代謝產生更高的還原力，是發(fā)酵合成還原性化合物的理想碳源[14]。Kim等比較了葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、甘油、半乳糖和乳糖等6種碳源對類胡蘿卜素合成和重組大腸桿菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)使用甘油效果最好，葡萄糖效果最差[15]。Lee等也發(fā)現(xiàn)在LB、2×YT、TB和MR培養(yǎng)基中加入葡萄糖會對類胡蘿卜素的產量產生顯著抑制，而在這些培養(yǎng)基中加入甘油則會提高類胡蘿卜素的產量[16]。目前報道的甘油轉化產品主要有乙醇、丁醇、1,3-丙二醇和丙酸等。許多微生物都可以利用甘油生產有價值的產品。大腸桿菌遺傳背景清晰、基因工程改造手段豐富、營養(yǎng)需求簡單和生長迅速，這些特性使其成為工業(yè)化規(guī)模下利用甘油發(fā)酵生產大宗化學品的理想選擇[12]。通過遺傳改良對甘油代謝途徑和產物合成途徑進行必要的修飾和改造，有助于實現(xiàn)在工業(yè)化規(guī)模下高效轉化甘油為其他產物[17]。

圖1 大腸桿菌中經(jīng)甘油到萜烯類化合物的代謝途徑表示包含多步催化反應Fig. 1 Construction of terpenoid synthetic pathway inE. coliby integrating heterologous gene.

大腸桿菌中存在兩條甘油代謝途徑[18]。好氧條件下，環(huán)境中的甘油主要通過被動運輸進入到大腸桿菌細胞中，首先通過細胞外膜上的孔道蛋白運輸?shù)郊毎苜|中，然后再通過細胞內膜上孔道蛋白GlpF (glpF編碼) 轉運到細胞胞漿 (圖1)[19]。進入胞漿后的甘油首先在甘油激酶GlpK作用下以ATP作為磷酰化供體進行磷?；缓罅柞；母视驮?-磷酸甘油脫氫酶GlpD (glpD編碼) 的作用下氧化獲得磷酸二羥丙酮 (DHAP)，在此過程中醌類物質作為電子受體；DHAP在磷酸丙糖異構酶TpiA (tpiA編碼)作用下發(fā)生異構化形成3-磷酸甘油醛并用于后續(xù)代謝過程[18]。3-磷酸甘油醛和丙酮酸是合成萜烯類化合物的直接前體，因此甘油到3-磷酸甘油醛途徑各基因協(xié)調表達，是合成β-胡蘿卜素的重要保證?？梢酝ㄟ^改造大腸桿菌好氧條件下甘油代謝途徑的相關基因來提高其對甘油的利用，促進目的產物的合成。

有氧條件下，甘油經(jīng)GlpF、GlpK、GlpD和TpiA催化合成3-磷酸甘油醛，這幾個蛋白分別由glpF、glpK、glpD和tpiA編碼而成，glpF和glpK在同一操縱子下，更換基因組上glpF啟動子，就可以同時對這兩個基因進行調控。本研究從實驗室構建的產β-胡蘿卜素工程菌株CAR015出發(fā)[20]，敲除了編碼3-磷酸甘油抑制物的glpR基因，并用實驗室構建的3個不同強度的調控元件M1-37、M1-46和M1-93[21]對甘油代謝途徑中的glpFK、glpD和tpiA進行單基因調控和多基因組合調控，提高重組大腸桿菌合成β-胡蘿卜素能力，同時為利用甘油為碳源合成其他萜烯類化合物及其他目標產物提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

氨芐青霉素、氯霉素，購自上海生工生物工程有限公司；質粒小量快速提取試劑盒購自美國Axygen公司；SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒購自生工生物工程 (上海) 有限公司；Trans 2K Plus DNA Marker、EasyTaqPCR SuperMix DNA聚合酶購自北京全式金物工程公司；RNA提取試劑盒 (RNeasy mini kit，Cat，No 74104) 購自Qiagen公司；PrimeSTARTMHS DNA聚合酶和DNase I (Recombinant DNase I，RNase-free，Cat，No 2270 A) 購自寶生物工程(大連) 有限公司；Gold View I型核酸染色劑購自北京索萊寶科技有限公司；Phusion TM超保真DNA聚合酶購自NEB公司；RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo Scientific；胡蘿卜素標品購自美國Sigma公司 (Cat. No. C4582)；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計，Shimadzu UV-2550 spectrophotometer (Shimadzu，Kyoto，Japan)；PCR擴增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動凝膠成像系統(tǒng)，AlphaImager HP；電轉儀MicroPulser；臺式高速離心機，Eppendorf 5415D；高速冷凍離心機，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色譜，Agilent Technologies Series 1200。實時定量PCR儀，CFX connectTMReal-Time system(Bio-Rad，Hercules，USA)。

1.1.3 菌株和質粒

本研究所用菌株和質粒見表1。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化鈉；氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素終濃度分別為100、34、50 μg/mL。LB固體培養(yǎng)基含1.5%的瓊脂。

LB+2%甘油培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g氯化鈉和20 mL甘油。

表1 本研究所用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

無鹽蔗糖培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g蔗糖。無鹽蔗糖固體培養(yǎng)基含1.5%的瓊脂。

1.2.2 β-胡蘿卜素產量和甘油殘留量的檢測方法

保存于?80 ℃ 的菌種在LB平板上劃線活化，挑取單菌落接種到15 mm×100 mm試管 (含4 mL LB培養(yǎng)基) 中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h，1%的接種量轉接到100 mL三角瓶 (含10 mL LB+2%甘油培養(yǎng)基) 中，30 ℃、250 r/min 培養(yǎng)24 h。收集菌液用于測定β-胡蘿卜素含量。

測定β-胡蘿卜素產量時，先取500 μL待測菌液，13 000 r/min 離心5 min，無菌水清洗后，用1 mL 丙酮懸浮沉淀，在55 ℃ 黑暗條件下萃取15 min，然后將樣品在14 000 r/min 下離心10 min，含有β-胡蘿卜素的上清過濾后用于測定β-胡蘿卜素產量。用高效液相色譜測定β-胡蘿卜素的濃度[24]。檢測條件：VWD 檢測器，Symmetry C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇∶乙腈∶二氯甲烷(21∶21∶8)，流速1.0 mL/min，時間25 min，柱溫30 ℃，檢測波長450 nm。每個待測樣品分別有3個平行樣，實驗結果取自3個平行的平均值。用購自Sigma公司的β-胡蘿卜素標準品構建HPLC標準曲線。

對于甘油殘留量的測定，取1 mL稀釋10倍的菌液，13 000 r/min 離心5 min，上清液經(jīng)濾膜過濾后用于測定甘油殘留量。用高效液相色譜測定甘油的濃度[24]。檢測條件：VWD檢測器，HPX-87H色譜柱，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，時間30 min，柱溫35 ℃[25]。每個待測樣品分別有3個平行樣，實驗結果取自3個平行的平均值。

1.2.3 一步同源重組調控基因

目前往往通過質粒高表達外源或內源基因，質粒表達基因可以引起質粒不穩(wěn)定、代謝負荷等弊端[26-27]；同時大腸桿菌具有多個基因在同一個操縱子下調控的現(xiàn)象，要高表達同一操縱子下多個基因，必然需要構建較大質粒，構建質粒難度更大、質粒穩(wěn)定性更低。染色體上直接用高強度啟動子調控基因，避免克隆大片段基因，提高改造效率[11]。另外菌株改造時，有時候需要降低某些基因的轉錄水平。本研究在染色體上可以通過一步同源重組和兩步同源重組的方法對基因進行調控。一步同源重組調控可以快速找出多個基因中的限速步驟[28]。兩步同源重組方法在染色體上直接對基因進行調控，可以進行無痕操作，減少殘留條帶對后續(xù)操作的影響[11-22]；采用一步同源重組的方法，用3個不同強度的啟動子M1-37、M1-46、M1-93對甘油代謝途徑的3個基因glpD、glpFK、tpiA分別進行單基因調控。相對于大腸桿菌中誘導后lacZ啟動子，調控元件M1-46、M1-37和M1-93的強度分別是它的1.7、2.5 和5倍[11-21]。用一對引物gene-FRT-up/gene-RBS-down來擴增用于轉化的條帶。對于glpD基因，使用glpD-FRT-up/glpD-RBS-down引物 (表2)，分別以M1-37、M1-46和M1-93的基因組DNA為模板擴增DNA片段，將片段電轉入含有pKD46的菌株Gly001的感受態(tài)細胞中，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板中過夜培養(yǎng)，挑選單克隆，用引物Kan-F/glpD-373-I-r進行PCR驗證(表2)[21-28]。驗證正確的克隆。采用同樣的方法調控glpFK和tpiA基因，所用引物序列在表2中列出。

1.2.4 兩步同源重組調控或敲除基因

兩步同源重組敲除或調控基因，在改造位點不留任何不必要的序列，有利于進行后續(xù)工程改造。用兩步同源重組的方法調控或敲除基因包括以下步驟，第一步同源重組，在將要敲除或調控基因位點插入一個catsacB基因片段；第二步同源重組中，將帶有敲除位點兩端同源臂的片段替換catsacB基因片段，完成敲除或調控。兩步同源重組敲除基因流程如圖2所示。首先，用電轉到已經(jīng)轉化了pKD46的CAR015感受態(tài)細胞中，用glpR-catsacB基因片段替換glpR基因，用引物cat-up/glpR-300-O-R來驗證成功轉化的菌，glpR-catsacB基因片段是以pXZ-CZ質粒為模板[22]，用引物glpR-cat-up/glpR-cat-down (表2) 擴增得到 (圖2A)。第二步同源重組，glpR-catsacB基因片段被glpR-Deletion DNA片段取代，glpR-Deletion是以大腸桿菌ATCC 8739的基因組為模板，用引物glpR-D-up/glpR-300-O-R擴增得到，其中glpR-D-up引物包含glpR基因ATG前50 bp同源臂序列和20 bp與glpR基因TAA后20 bp同源序列，glpR-300-O-R為位于glpR基因后300 bp位置的一段反向互補序列，PCR擴增得到的第二步同源重組片段分別含glpR上游50 bp同源臂和下游300 bp同源臂序列。經(jīng)第二步同源重組，可敲除掉glpR基因 (圖2B)。第二步重組正確菌株在含有蔗糖的無鹽LB培養(yǎng)基富集。在蔗糖存在的情況下，表達sacB基因的菌株因為在培養(yǎng)過程中積累果聚糖對細胞產生毒性而被殺死。cat-sacB基因簇被替換掉的細胞被初步富集[11,28-29]。隨后，挑單菌落分別在LB和氯霉素平板上進行抗性篩選，挑選LB上生長而氯霉素上不生長的菌，用引物glpR-400-O-F/glpR-300-O-R進行PCR驗證。將敲除glpR的菌命名為Gly001。

[11]所述方法兩步同源重組調控基因glpF、glpD和tpiA。所用引物見表2，構建菌株及所用質粒見表1。

圖2 基因敲除流程圖 (A：第一步同源重組；B：第二步同源重組)Fig. 2 Modulation of gene deletion by the two-step recombination method. (A) The first recombination step. (B) The second recombination step.

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this work

續(xù)表2

1.2.5 調控基因轉錄水平測定

為了確定人工調控元件調控相應基因后轉錄水平，我們用實時定量PCR (Q-PCR) 的方法，測定調控前后基因轉錄水平的改變。將待測菌取單菌落接種于含3 mL LB的試管中，培養(yǎng)過夜，以1%的接種量轉接，30 ℃培養(yǎng)5 h后，按照RNA提取試劑盒要求收集一定菌體，液氮速凍后，RNA提取試劑盒提取RNA，并用DNase I去除污染的DNA，用RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit準備cDNA，用Q-PCR儀進行Q-PCR。16S rRNA基因為內參基因，用2-ΔΔCt法計算基因的相對轉錄水平。Q-PCR引物見表2。

2 結果與分析

2.1glpR基因的敲除

GlpR是三磷酸甘油的阻遏蛋白，在葡萄糖存在下對大腸桿菌的甘油代謝起阻遏作用[30-33]。因此，本研究首先敲除編碼GlpR的基因glpR，防止GlpR對甘油代謝的阻抑作用，同時，為重組工程菌共代謝葡萄糖和甘油做準備。

本研究用兩步同源重組的方法，敲除出發(fā)菌株CAR015中的glpR，特異引物驗證陽性克隆 (圖3)。

結果如圖3所示，用引物glpR-400-O-F/ glpR-300-O-R進行PCR驗證，出發(fā)菌株CAR015為模板，擴增出1 500 bp條帶，而敲除glpR后，用同樣引物擴增，得到約700 bp條帶，因此敲除成功，獲得菌株命名為Gly001。

發(fā)酵Gly001，發(fā)現(xiàn)敲除glpR后，β-胡蘿卜素產量比CAR015降低約8%，生長基本不受影響 (圖4)，可以作為出發(fā)菌株，調控甘油代謝途徑各基因。

2.2 調控甘油代謝途徑基因對β-胡蘿卜素產量影響

采用一步同源重組方法，用M1-37、M1-46和M1-93號人工調控元件調控甘油代謝途徑中的glpFK、glpD和tpiA基因。

結果表明，M1-37、M1-46和M1-93調控glpFK基因后，生長分別為Gly001的0.96、0.76和0.57倍，β-胡蘿卜素產量分別為Gly001的0.96、0.76和0.54倍，甘油消耗分別為CAR015的1.16、1.13和1.12倍，說明3個固定強度調控glpFK后，對細胞生長和β-胡蘿卜素產量都有一定抑制作用。TpiA調控后，生長基本不受影響(圖4A)，β-胡蘿卜素產量略高于Gly001，分別比Gly001提高了29%、24%和17%，說明，改變tpiA的強度可以提高β-胡蘿卜素產量。

M1-37和M1-93調控glpD基因后，β-胡蘿卜素產量分別降低了8%和19%，而生長基本沒有影響 (圖4)，但是，用M1-46號人工調控元件調控glpD后，生長和β-胡蘿卜素產量明顯升高，β-胡蘿卜素產量和產率分別達64.82 mg/L和16.44 mg/g DCW，分別為CAR015的4.86倍和2.64倍。OD600達12.19，為CAR015的1.84倍，說明適當強度的人工調控元件調控glpD，可以有效提高β-胡蘿卜素產量。

2.3 兩基因組合調控提高β-胡蘿卜素產量

因為M1-46調控glpD后，β-胡蘿卜素產量明顯提高，所以從glpD調控菌株出發(fā)，分別與glpFK和tpiA組合調控，觀察兩基因組合調控后，對細胞生長和β-胡蘿卜素產量的影響。

為了便于對基因組合調控，都用兩步同源重組的方法調控各基因。首先從Gly001出發(fā)，兩步法用M1-46號啟動子調控glpD基因，得到測序正確菌株，命名為Gly002。Gly002和glpD-M1-46相比，兩者都為M1-46調控，但是在glpD-M1-46的啟動子前面有一個FRT-Km-FRT片段，從β-胡蘿卜素產量來看，Gly002產量為68.9 mg/L，略高于glpD-M1-46 (產量為64.82 mg/L) (圖5)。

從Gly002出發(fā)，用M1-37、M1-46和M1-93人工調控元件分別調控glpFK和tpiA基因，觀察兩基因組合調控對β-胡蘿卜素產量的影響。

圖4 單基因調控后菌株β-胡蘿卜素產量及生長Fig. 4 β-carotene production and cell growth after modulating single gene.

圖5 雙基因調控后菌株β-胡蘿卜素產量及生長Fig. 5 β-carotene production and cell gowth after modulating double genes.

結果表明，單獨調控tpiA基因時，M1-37號調控后，β-胡蘿卜素產量最高 (圖4)。在Gly002基礎上調控tpiA時，M1-37號調控后，β-胡蘿卜素產量反而更低，說明同樣的調控元件，在不同菌株中，對目標產物的影響不同。GlpFK調控后，產量沒有提高，反而下降，分別比出發(fā)菌株Gly002降低8%、13%和17%。雙基因組合調控得到β-胡蘿卜素產量最高菌株為Gly002，tpiA-M1-46，產量達72.45 mg/L，比Gly002提高了8%，命名為Gly003。

2.4 調控對轉錄水平的影響

M1-37和M1-93調控glpD后，β-胡蘿卜素產量有一定降低，而生長基本沒有影響 (圖4)，但是，用M1-46號人工調控元件調控glpD后，生長和β-胡蘿卜素產量明顯升高。glpFK和tpiA調控后，對細胞生長和β-胡蘿卜素產量也有一定影響。本文所用的3個不同強度的啟動子是組成型啟動子，對不同基因可能啟動強度不同；另外，所調控基因在細胞中原始轉錄水平不同，調控后相對轉錄水平是升高還是降低，結果必定不同。為了研究對基因調控后，轉錄水平與生長及β-胡蘿卜素產量的關系，本文用Q-PCR方法，測定了基因調控菌株中，相對應基因轉錄水平的改變。本文以出發(fā)菌株Gly001中相對應的基因為1，來計算改造后基因的相對轉錄水平。

圖6 調控對轉錄水平的影響Fig. 6 Relative expression level ofglpF,glpK,glpDandtpiAafter modulated by M1-37, M1-46 and M1-93.

由圖6可知，從Gly001出發(fā)單獨調控glpFK，M1-37、M1-46和M1-93調控使glpF和glpK轉錄水平依次升高 (圖6)。調控后glpF基因的轉錄水平都低于對照的轉錄水平，但是，只有M1-37調控使glpK的轉錄水平低于對照，是對照的0.6倍，M1-46和M1-93調控都使glpK轉錄水平高于對照，分別是對照的1.2和4.6倍，因此，目前glpFK的轉錄水平依然高，推測進一步降低glpFK的轉錄水平可以提高β-胡蘿卜素產量，增加細胞生長速度，建議進一步用調控元件文庫調控glpFK基因，以實現(xiàn)提高β-胡蘿卜素產量，增加細胞生長速度的目的。

M1-37和M1-93調控使glpD轉錄水平升高，分別是對照的1.75和5.28倍 (圖6)，M1-46調控使glpD轉錄水平降低了68%，調控菌株glpD-M1-46細胞生長和β-胡蘿卜素產量明顯提高，說明glpD轉錄水平降低，有利于細胞生長及β-胡蘿卜素合成。

M1-37、M1-46和M1-93調控使tpiA轉錄水平依次升高，分別是對照的1.78、2.72和5.63倍 (圖6)，β-胡蘿卜素產量都有一定提高(圖4)，說明提高tpiA的強度可以提高β-胡蘿卜素產量。

甘油代謝包括有氧代謝和厭氧代謝兩條途徑。改造甘油厭氧代謝途徑基因集中在提高乙醇、乳酸等產物生成[17-34]；Mazumdar 等在微氧條件下過表達甘油有氧代謝中的glpK和glpD加速了甘油利用，提高了L-乳酸和D-乳酸的產量[18-35]。Applebee 在進行適應性進化研究時發(fā)現(xiàn)，降低glpK轉錄水平，可以減少丙酮醛(Methyglyoxal) 積累，降低細胞毒性，有利于細胞生長[36]。本研究發(fā)現(xiàn)在有氧條件下，催化甘油轉化成DHAP的glpFK和glpD轉錄水平降低，有利于細胞生長和β-胡蘿卜素合成，而分解DHAP的tpiA轉錄水平提高有利于細胞生長和β-胡蘿卜素產量。丙酮醛主要來自甘油代謝途徑的DHAP，經(jīng)丙酮醛合成酶催化形成。本研究中降低glpFK和glpD轉錄水平，可以通過減少DHAP合成，進而減少丙酮醛積累，從而加快細胞生長和提高β-胡蘿卜素產量。

3 結論

本研究在高產β-胡蘿卜素的重組大腸桿菌CAR015基礎上，通過用不同強度的人工調控元件調控甘油代謝途徑的glpFK、glpD和tpiA基因，系統(tǒng)研究了甘油代謝途徑各基因轉錄水平對β-胡蘿卜素產量的影響。結果表明，降低glpD基因的轉錄水平可以顯著提高重組大腸桿菌的生長速度和β-胡蘿卜素產量；glpFK基因的轉錄水平與β-胡蘿卜素合成能力呈反比，本研究所用固定強度啟動子調控glpFK都不能使β-胡蘿卜素產量提高，需要強度更低的調控元件調控glpFK基因，以期提高β-胡蘿卜素產量。提高tpiA的轉錄水平可以適當增加β-胡蘿卜素的產量；組合調控glpD和tpiA基因后，得到產量最高菌株Gly003，小搖瓶發(fā)酵24 h，β-胡蘿卜素產量達72.45 mg/L、產率達18.65 mg/g DCW，是高產β-胡蘿卜素重組大腸桿菌CAR015的5.23倍和1.99倍。研究結果表明，適當程度表達甘油代謝途徑的glpD和tpiA基因，可以有效提高β-胡蘿卜素產量及細胞生長速度，這個策略可以用于大腸桿菌生產其他萜烯類化合物。

REFERENCES

[1] Giovannucci E, Ascherio A, Rimm EB, et al. Intake of carotenoids and retinol in relation to risk of prostate-cancer. J Natl Cancer Inst, 1995, 87(23): 1767–1776.

[2] Malvy DJM, Burtschy B, Arnaud J, et al. Serum beta-carotene and antioxidant micronutrients in children with cancer. Int J Epidemiol, 1993, 22(5): 761–771.

[3] Yoon SH, Lee SH, Das A, et al. Combinatorial expression of bacterial whole mevalonate pathway for the production of β-carotene inE.coli. J Biotechnol, 2009, 140(3/4): 218?226.

[4] Yoon SH, Park HM, Kim JE, et al. Increased β-carotene production in recombinantEscherichia coliharboring an engineered isoprenoid precursor pathway with mevalonate addition. Biotechnol Prog, 2007, 23(3): 599–605.

[5] Yuan LZ, Rouvière PE, LaRossa RA, et al. Chromosomal promoter replacement of the isoprenoid pathway for enhancing carotenoid production inE.coli. Metab Eng, 2006, 8(1): 79–90.

[6] Lemuth K, Steuer K, Albermann C. Engineering of a plasmid-freeEscherichia colistrain for improvedin vivobiosynthesis of astaxanthin. Microb Cell Fact, 2011, 10: 29.

[7] Ajikumar PK, Tyo K, Carlsen S, et al. Terpenoids: opportunities for biosynthesis of natural product drugs using engineered microorganisms. Mol Pharm, 2008, 5(2): 167–190.

[8] Alper H, Jin YS, Moxley JF, et al. Identifying gene targets for the metabolic engineering of lycopene biosynthesis inEscherichia coli. Metab Eng, 2005, 7(3): 155–164.

[9] Farmer WR, Liao JC. Precursor balancing for metabolic engineering of lycopene production inEscherichia coli. Biotechnol Prog, 2001, 17(1): 57–61.

[10] Choi HS, Lee SY, Kim TY, et al.In silicoidentification of gene amplification targets for improvement of lycopene production. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(10): 3097–3105.

[11] Zhao J, Li QY, Sun T, et al. Engineering central metabolic modules ofEscherichia colifor improving β-carotene production. Metab Eng, 2013, 17: 42–50.

[12] YazdaniSS, Gonzalez R. Anaerobic fermentation of glycerol: a path to economic viability for the biofuels industry. Curr Opin Biotech, 2007, 18(3): 213–219.

[13] Abdel-Rahman MA, Tashiro Y, Sonomoto K. Recent advances in lactic acid production by microbial fermentation processes. Biotechnol Adv, 2013, 31(6): 877–902.

[14] Clomburg JM, Gonzalez R. Biofuel production inEscherichia coli: the role of metabolic engineering and synthetic biology. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 86(2): 419–434.

[15] Kim J, Kong MK, Lee SY, et al. Carbon sourcesdependent carotenoid production in metabolically engineeredEscherichia coli. World J Microb Biotechnol, 2010, 26(12): 2231–2239.

[16] Lee PC, Mijts BN, Schmidt-Dannert C. Investigation of factors influencing production of the monocyclic carotenoid torulene in metabolically engineeredEscherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 65(5): 538–546.

[17] Durnin G, Clomburg J, Yeates Z, et al. Understanding and harnessing the microaerobic metabolism of glycerol inEscherichia coli. Biotechnol Bioeng, 2009, 103(1): 148–161.

[18] Mazumdar S, Blankschien MD, Clomburg JM, et al. Efficient synthesis of L-lactic acid from glycerol by metabolically engineeredEscherichia coli. Microb Cell Fact, 2013, 12: 7.

[19] Heller KB, Lin ECC, Wilson TH. Substratespecificity and transportproperties of the glycerol facilitator ofEscherichia coli. J Bacteriol, 1980, 144(1): 274–278.

[20] Zhang XL, Li QY, Tang JL. Construction methods and applications of a β-carotene recombinant microorganisms: CN, 201610866681.9 (in Chinese).張學禮, 李清艷, 唐金磊. 生產β-胡蘿卜素的重組微生物及構建方法和應用: 中國, 201610866681.9.

[21] Lu J, Tang JL, Liu Y, et al. Combinatorial modulation ofgalPandglkgene expression for improved alternative glucose utilization. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(6): 2455–2462.

[22] Tan ZG, Zhu XN, Chen J, et al. Activating phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in combination for improvement ofsuccinate production. Appl Environ Microbiol, 2013, 79(16): 4838–4844.

[23] Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coliK-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(12): 6640–6645.

[24] Yoon SH, Lee SH, Das A, et al. Combinatorial expression of bacterial whole mevalonate pathway for the production of β-carotene inE.coli. J Biotechnol, 2009, 140(3/4): 218–226.

[25] Zhang XL, Jantama K, Moore JC, et al. Metabolic evolution of energy-conserving pathways for succinate production inEscherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(48): 20180–20185.

[26] Keasling JD. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol, 2008, 3(1): 64–76.

[27] Albermann C, Trachtmann N, Sprenger GA. A simple and reliable method to conduct and monitor expression cassette integration into theEscherichia colichromosome. Biotechnol J, 2010, 5(1): 32–38.

[28] Zhao J, Liu Y, Li QY, et al. Modulation of isoprenoid gene expression with multiple regulatory parts for improved β-carotene production. Chin J Biotech, 2013, 29(1): 41–55 (in Chinese).趙婧, 劉怡, 李清艷, 等. 多個調控元件調控萜類合成途徑基因表達提高β-胡蘿卜素的生產. 生物工程學報, 2013, 29(1): 41–55.

[29] Chen J, Zhu XN, Tan ZG, et al. Activating C4-dicarboxylate transportersDcuBandDcuCfor improving succinate production. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(5): 2197–2205.

[30] Yang B, Larson TJ. Action at a distance for negative control of transcription of theglpDgene encoding sn-glycerol 3-phosphate dehydrogenase ofEscherichia coliK-12. J Bacteriol, 1996, 178(24): 7090–7098.

[31] Zeng G, Ye S, Larson TJ. Repressor for the sn-glycerol 3-phosphate regulon ofEscherichia coliK-12: primary structure and identification of the DNA-binding domain. J Bacteriol, 1996, 178(24): 7080–7089.

[32] Larson TJ, Ye SZ, Weissenborn DL, et al. Purification and characterization of the repressor for the sn-glycerol 3-phosphate regulon ofEscherichia coliK12. J Biol Chem, 1987, 262(33): 15869–15874.

[33] Schweizer H, Boos W, Larson TJ. Repressor for the sn-glycerol-3-phosphate regulon ofEscherichia coliK-12: cloning of theglpRgene and identification of its product. J Bacteriol, 1985, 161(2): 563–566.

[34] Cintolesi A, Clomburg JM, Rigou V, et al. Quantitative analysis of the fermentative metabolism of glycerol inEscherichia coli. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(1): 187–198.

[35] Mazumdar S, Clomburg JM, Gonzalez R.Escherichia colistrains engineered for homo fermentative production of D-lactic acid from glycerol. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(13): 4327–4336.

[36] Applebee MK, Joyce AR, Conrad TM, et al. Functional and metabolic effects of adaptive glycerol kinase (GLPK) mutants inEscherichia coli. J Biol Chem, 2011, 286(26): 23150–23159.

(本文責編 陳宏宇)

Improving β-carotene production inEscherichia coliby metabolic engineering of glycerol utilization pathway

Yue Dong1,2＊, Kunle Hu3＊, Xinglin Li1, Qingyan Li2, and Xueli Zhang2
1College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin300457,China
2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences,Tianjin300308,China
3College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Techology,Luoyang471023,Henan,China

Glycerol is a byproduct during biodiesel production. It is an important feedstock for fermentation due to its low price and high reduced status. Multiple genes of the glycerol utilization pathway were modulated in a previously engineered high β-carotene producingEscherichia colistrain CAR015 to enhance glycerol utilization capability for improving isoprenoids production. TheglpRgene, encoding glycerol 3-phosphate repressor, was firstly deleted. TheglpFK,glpDandtpiAgenes were then modulated by three artificial regulatory parts, M1-37, M1-46 and M1-93, respectively. β-carotene titer reached 64.82 mg/L after modulatingglpDwith M1-46, which was 4.86 times higher than that of CAR015, and glycerol consumption rate also increased 100%. ModulatingtpiAled to a little increase of β-carotene titer, whereas modulatingglpFKled to a little decrease of β-carotene titer. This demonstrated that GlpD was a rate-limiting step in glycerol utilization pathway. Q-PCR ofglpF,glpK,glpD andtpiAresults showed that decrease the transcription level ofglpF,glpK,glpD, or decrease the transcription level oftpiAcould increase the cell growth and β-carotene production, probably for the decrease of methylglyoxal toxicity. ModulatingglpDandtpiAgenes in combination resulted in the best strain Gly003, which produced 72.45 mg/L β-carotene with a yield of 18.65 mg/g dry cell weight. The titer was 5.23 and yield 1.99 times of that of the parent strain CAR015. Our work suggested that appropriate activation ofglpDandtpiAgenes in glycerol utilization pathway could effectively improve β-carotene production. This strategy can be used for production of other terpenoids inE. coli.

β-carotene, terpenoids, glycerol metabolism,Escherichia coli

s:Xinglin Li. Tel/Fax: 86-22-60601329; Email: lxlszf@tust.edu.cn

Received:July 22, 2016;Accepted:December 6, 2016

Supported by:Natural Science Foundation of Tianjin (No. 15JCYBJC49400), Tianjin Key Technology R&D Program of Tianjin Municipal Science and Technology Commission (No. 12ZCZDSY14700).

Qingyan Li. Tel/Fax: 86-22-84861946; Email: li_qy@tib.cas.cn

*These authors contributed equally to this work.

天津市自然科學基金 (No. 15JCYBJC49400)，天津市科技支撐計劃重點項目 (No. 12ZCZDSY14700) 資助。

時間：2016-12-27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20161227.1416.001.html